"מעורבות תאי גלייה ואינטרלאוקין- 1 ברגישות מרכזית המושרה על ידי סדרות גירויים נוסיספטים חוזרות"

"מעורבות תאי גלייה ואינטרלאוקין- 1 ברגישות מרכזית המושרה על ידי סדרות גירויים נוסיספטים חוזרות" חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה מאת נדב יהודה זיו Nadav Yehuda Ziv הוגש לסנט האוניברסיטה העברית בירושלים /100/10

"מעורבות תאי גלייה ואינטרלאוקין- 1 ברגישות מרכזית המושרה על ידי סדרות גירויים נוסיספטים חוזרות" חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה מאת נדב יהודה זיו Nadav Yehuda Ziv הוגש לסנט האוניברסיטה העברית בירושלים /100/10 0

עבודה זו נעשתה בהדרכתם של: פרופ' יהודה שביט פרופ' מיכאל טל 1

שלמי תודה זכות נעימה היא לי להודות לאנשים שליוו אותי ותמכו בי לאורך עבודת הדוקטורט. ראשית אני רוצה להודות למוריי ומנחיי פרופ' מיכאל טל ופרופ' יהודה )אודי( שביט על שהדריכו וסיפקו לי את מלוא התשתית הפיסית והרעיונית לביצוע מחקרי. אני מודה על שהכירו לי את התחום המאתגר והמרתק של חקר הכאב. תודה על ההנחיה הבונה, על המיקוד בזמן שהתפזרתי, על התבונה והתובנות במהלך הדיונים המקצועיים והאישיים. אני מודה על יחסי העבודה הנעימים, על התנהגותם השקולה והיציבה במהלך העליות והמורדות במחקרי. שימשתם לי דוגמה ומופת כחוקרים וכבני אדם. לאורך כל הדרך, תמיד הרגשתי שטובתי לנגד עינכם. תודה לחברי הועדה המלווה- פרופ' מרשל דבור, פרופ' מנחם חנני ופרופ' רז ירמיה על הביקורת הבונה והעצות הנבונות בשלבי העבודה השונים. ברצוני להודות באופן מיוחד לפרופ' מרשל דבור על ההערות הרבות, השאלות הקשות והדיון המתמשך לאורך עבודתי. בזכות מומחיותו, הבנתו העמוקה בתחום ואופן חשיבתו המחקרית כל הערה שתרם סייעה לי לבנות בסיס איתן למחקרי וכולן הפכו לנדבך חשוב בעבודה זו. תודה מיוחדת למר מוטי עטיה על העזרה הטכנית הרבה בבניית ציוד עבור ניסויי וכן על ההסברים המלומדים בנושאי תורת החשמל והאלקטרוניקה, אך קודם לכל תודה על היחס החברי. לחברי הסטודנטים: עדי ניצן לוקס, ד"ר גילי וולף, קרן פרידל, ד"ר ערן גבאי ושגיא גודס- אני מודה על העבודה המשותפת, הדיונים המקצועיים, חילופי הידע והרעיונות. כמו גם העזרה ההדדית, שיחות העידוד, ובעיקר על החברות. מחקר זה לא היה מתאפשר ללא הסיוע הפיננסי מקרנות המחקר: הקרן הלאומית למדע )ISF( וכן האגודה הישראלית לקרנות מחקר וחינוך מענק דוקטורנטים במדעי החברה מס'.)IFT( 02 אחרונה אהובה, מאיה רעייתי. תודה שאפשרת לי את התקופה הכי יפה בחיי. 4

ל-.2 nd 5 0.1 תקציר: או 2 nd לסדרה, 3 rd עבודה זו עוסקת בתופעה של רגישות מרכזית sensitization( )central בכאב. רגישות מרכזית הינה תגובה מוגברת של נוירונים נוסיספטים במערכת העצבים המרכזית לקלט אפרנטי נורמלי או תת-ספי. תהליך זה מתרחש בעקבות גירויים מזיקים והוא משמש כאחד המנגנונים המסבירים את הגברת התחושה בכאב אקוטי ואף את שימור תחושת הכאב במצבים כרוניים. המטרה הראשונית של מחקר זה הייתה לבחון את המעורבות של תאי גליה ושל הציטוקין IL-1 במודל של רגישות מרכזית. windup לצורך כך התחלנו בבחינת מודל כאב אלקטרופיסיולוגי ידוע שהוא מודל ה-.wind-up התחלנו בכיול השיטה ליצירת ע"פ תיאורי השיטה בספרות המחקרית המתאימה. תופעת ה wind-up נוצרת בעקבות גירוי נוסיספטי חוזר )רפטטיבי( בתדירות נמוכה )0.3 )5Hz המביא להגברה מדורגת בפוטנציאלי פעולה בתאי עצב בקרן הדורסלית של חוט השדרה. אחת הדרכים למדוד wind-up מבוססת על הפעלת מנגנון 'רפלקס הרתיעה הנוסיספטי' reflex( )nociceptive withdrawal שמיועד להגנה על הגוף מגירויים מזיקים. מדידה כזאת של הרפלקסים נמצאה בעבר כבעלת מתאם גבוה עם פעילות התאים בקרן הדורסלית. לאחר קביעת פרוטוקול גירויים בן שלוש סדרות גירוי ועם סיום שלב ניסויי הכיול מצאנו להפתעתנו כי בעת גירוי בשלוש סדרות גירוי זהות עוקבות, התגובות לסדרות השנייה והשלישית היו חזקות משמעותית מהתגובה לסדרה הראשונה. הגברה זו התקבלה במרווח של 10 דקות בין הסדרות, טווח זמן גדול בהרבה מהמקובל. מקובל לחשוב כי ההשפעה של סדרת WU אחת נמשכת עשרות שניות לכל היותר )כאשר בדיקת משך ההשפעה מבוצעת ע"י מתן גירויי בדיקה בודדים(. מכך הסקנו כי הדרך להעריך את משך האפקט של סדרת WU היא ע"י סדרת WU נוספת. על פי הבנתנו, תצפית זו משקפת את המעבר המהיר במערכת העצבים המרכזית מתגובה בסיסית לגירוי מכאיב לרגישות מוגברת לכאב, כלומר, רגישות מרכזית. לאחר בירור ספרותי מעמיק לא מצאנו לתופעה זו אזכור ותיאור ברור. בעקבות כך הגדרנו את אפיון תופעת ההגברה )אשר כונתה מאז )WoW: Wind-up of Wind-up כמטרתה הראשונה של עבודה זו. ראשית, בחנו פרמטרים של הגירוי ליצירת,WoW ותוך כדי כך הגדרנו את התנאים לקבלת תגובת.WoW בהמשך כאשר מודל ה- WoW התקבל באופן הדיר וזכה לתיקוף מהימן, בחנו מספר מנגנונים העשויים לגרום לתופעה ובדקנו את השפעת ה- WoW על התנהגות כאב. לבסוף, בסדרת ניסויים בהם בדקנו את ההשפעה של גירויים טבעיים קודמים על ה- WoW מצאנו הסבר לשאלה מדוע תופעה זו לא דווחה קודם לכן. תקציר תוצאות המחקר: פרמטרים העשויים להשפיע על ה :WoW בדיקות תדירות: גירוי נוסיספטי בעוצמה המפעילה סיבי C אשר ניתן בתדירות נמוכה )0.1Hz( מטווח המייצר WU לא מייצר WoW בסדרות השנייה והשלישית, אולם התגובות לסדרת גירויים רביעית בתדירות של,1Hz הראו עליה מהירה בעוצמת הרפלקס וצורת עקומת WU מוגבר. עובדה זו מלמדת כי גם גירוי בתדירות נמוכה עשוי להביא לריגוש מרכזי. גירויים בתדירות 1Hz ו- 2Hz יצרו.WoW עוצמת הגירוי: הבדיקה נעשתה עבור גירויים בעוצמות הבאות: & 10mA,4,0.1.,2 מצאנו כי גירויים בעוצמה שלא מפעילה סיבי C לא יוצרים.WoW גירויים שניתנו בעוצמה מעל 2mA הראו.WoW תוצאה מפתיעה התקבלה בעת גירוי בעוצמה חזקה מאוד של.10mA בניסוי זה הנחנו כי כבר לסדרת הגירוי הראשונה נקבל רמת תגובה מקסימלית המתאימה המתרחש בזמן )דקות( שבין הסדרה 1 st ולא כך, צורת העקומות נשארה דומה לדפוס הידוע ב.WoW תוצאה זו מרמזת על מנגנון קבוע

האם תהליך ההגברה מתפתח במרווח שבין הסדרות או כתלות במספר הגירויים? מצאנו כי סדרת גירויים ארוכה )המדמה 1 סדרות רצופות( לא מספיקה ליצירת התגובה המוגברת של תופעת ה.WoW הגברה משמעותית בסדרה נוספת התקבלה רק לאחר זמן ההמתנה. כלומר שהמרווח הבין-סדרתי חיוני עבור מנגנוני התפתחות ה- WoW. בסיום שלב האפיון עברנו לברר מנגנונים העשויים לגרום להגברה הנצפית במהלך סדרות הגירויים: 1- האם תהליך ההגברה מתרחש במערכת העצבים המרכזית או בפריפריה. 0- מעורבות קולטני NMDA ב.WoW 1- האם הסמן לרגישות מרכזית- perk מעורב בתהליך. 4- האם תאי מיקרוגליה מעורבים ביצירת ה?WoW 5- האם הגברת ה WoW נובעת משחרור ופעילות אינטרלאוקין- 1 אנדוגני? האם תופעת ה WoW הינה מרכזית או פריפרית? שאלה זו בחנו מכמה היבטים. האם התופעה הנצפית מקורה בשינוי בתהליך של שריר פריפרי או הינה תגובה עצבית בחוט השדרה כפועל יוצא של הגירוי הפריפרי? לשם כך בצענו רישום מקביל של EMG מהשריר ומסיבי עצב שהופרדו מהעצב הסכיאטי )מנותקים מהפריפריה אך מחוברים למרכז(. מצאנו מתאם גבוה )0.77 = r( בין הפעילות העצבית שנרשמה בסיבי העצב לבין פעילות השריר. כלומר שהפעילות הנמדדת בשריר הינה תוצר ישיר של פעילות עצבית מרכזית ואינה תהליך פריפרי. באיזו רמה של מערכת העצבים המרכזית מתרחשת ההגברה? לשם כך בצענו שעה לפני סדרות הגירוי, חתך בחוט השדרה ברמת T 3-4 על מנת להפריד את המוח מחוט השדרה. בניסויים אלו נמצא כי הפרדה זו הפחיתה, אם כי לא מנעה, תגובות,WU ואילו תופעת ה- WoW נחסמה. פגיעה נוספת באזור הלומברי של חוט השדרה הפסיקה את תגובות הרפלקס לחלוטין. ממצא זה מראה כי תופעת ה WU משקפת פעילות של נוירונים באזור הלומברי בחוט השדרה. יחד עם זאת, התופעה שבה בפרפרט עם חתך שדרתי, סדרת גירויים ראשונה מביאה להפחתה בתגובות לסדרות הבאות במקום הגברה מעידה שיש צורך באזורים על-שדרתיים עבור יצירת ה.WoW מה חלקם של קולטני NMDA בתהליך ההגברה של?WoW לצורך כך השתמשנו בחסם הלא תחרותי.MK-801 כאשר הוזרק החסם 30 דקות לפני הגירוי הראשון נחסמה תופעת ההגברה לחלוטין. על מנת לבחון האם ניתן להפוך )reverse( את רמת ההגברה לאחר שכבר נוצרה, בדקנו מה תהיה השפעת החסם במידה ויינתן לאחר סדרת הגירויים השנייה? מתברר כי הסדרה הבאה ה- 3 rd )שניתנה /1 דקות מההזרקה( נשארת גבוהה, אולם סדרה רביעית )40 דקות מההזרקה( מופחתת לרמת הבסיס. מכאן הסקנו כי קולטנים אלו חיוניים עבור יצירת WU אך גם עבור שימור ה.WoW שאלנו האם תהיה עליה במספר התאים המבטאים perk בעקבות סדרת גירויי?WU הסמן (Phosphorylated extracellular signal-related kinase ( perk הינו קינזה העוברת זירחון ספציפי בתאי הקרן הדורסלית בעת הפעלת נוסיספטורים ונחשבת לסמן מוליקולרי עבור ריגוש מרכזי. מצאנו עליה משמעותית במספר התאים שהראו צביעת perk לאחר 10 דקות מהגירוי הראשון. יתרה מכך, זנים מוטנטיים של עכברים המגודלים במעבדתנו, הנבדלים משמעותית בהתנהגות כאב בזאלית ובהתאמה בתגובת ה WoW שלהם )זן הבר C57BL/6 CBA X וכן זן הבר 6

WoW כלומר שקיים קשר בין תגובת ה-.pERK הראו ביטוי מתאים של רמת התאים המבטאים,)129/sv X C57BL/6 לבין ריגוש מרכזי. האם תאי מיקרוגליה מעורבים ביצירת ה?WoW ידוע כי הפעלת נוסיספטורים עשויה לשפעל תאי מיקרוגליה אשר בהמשך עשויים לתרום להגברת תהליך הריגוש המרכזי, בין היתר על ידי שחרור ציטוקינים כדוגמתIL-1. על מנת לבחון מעורבות של תאי מיקרוגליה טיפלנו בחיות בחסם המיקרוגליה האנטיביוטי מינוציקלין. החומר הוזרק 3 פעמים במהלך 04 שעות לפני הגירוי הראשון ונמצא כי הוא מפחית WU משמעותית. תגלית זו עשויה להעיד על מעורבות מיקרוגליה בתהליכים אקוטיים של יצירת ריגוש מרכזי. האם הגברת ה WoW נובעת משחרור ופעילות אינטרלאוקין- 1 אנדוגני? לצורך כך ערכנו ניסויים בזן חיות מוטנטיות בעלות פגיעה בתפקוד מערכת.IL-1 לחילופין, בניסויים אחרים, חסמנו באמצעות אנטגוניסט ספציפי את פעילות IL-1 בזן הבר ובדקנו את ההשפעה על יצירת ה.WoW בניסויים אלו נמצא כי הציטוקין אינטרלאוקין- 1 ככל הנראה אינו ממלא תפקיד בתהליך ההגברה של.WoW בסיום השלב המנגנוני בקשנו לברר את השפעת גירוי WU ו- WoW על התנהגות הכאב: האם סדרות הגירויים משפיעות על התנהגות הכאב של החיה בעקבות הפעלת הנוסיספטורים? במחקר זה נמצאה לראשונה השפעה התנהגותית של גירוי WU ו.WoW מצאנו כי חיות אשר גורו בסדרת גירוי אחת )WU( פיתחו רגישות מוגברת לגירוי מכני )אלודיניה( ורגישות לחום. מעניין לציין כי מתן של 2 סדרות או 3 סדרות גירוי לא הביאו לתגובת כאב מוגברת מעבר לזו שנצפתה בעקבות סדרת הגירוי הראשונה. יתכן כי ניתן להסיק מניסוי זה כי התהליך העיקרי מבחינת הגירוי והגברת הרגישות לכאב מתרחש בעקבות הסדרה הראשונה וכי הסדרות הבאות משקפות את ההשפעה של הגירוי הראשון. הראינו כי סדרות הגירויים גורמות לתגובת כאב מוגברת, ומכיוון שחסימת קולטני NMDA מביאה לביטול,WoW בדקנו האם חסימת קולטני NMDA תמנע התפתחות של תגובת כאב מוגברת בעקבות מתן סדרות הגירוי? מצאנו כי ההשפעה של MK-801 כחסם של NMDA הינה דיפרנציאלית באופנויות שונות; היא חוסמת התפתחות אלודיניה למגע לגירוי מכני, אך איננה משפיעה על רגישות מוגברת לגירוי חום. החיות שטופלו בחסם של קולטני NMDA נבדקו אחרי 7 ימים בפרוטוקול של.WoW הן לא פיתחו תגובת,WoW ממצא שמצביע על כך שחסימת קולטני NMDA מנעה ההתפתחות של ריגוש מרכזי בחוט שדרה גם שבוע לאחר הטיפול. ממצא חשוב נוסף מניסוי זה הראה כי חיות שגורו בסדרת WU ללא חסימת קולטני ה- NMDA הראו WoW מוגבר שבוע אחרי הגירוי. ממצא זה מלמד כי המידע הנוסיספטי עשוי להישמר זמן רב )ריגוש ארוך טווח( לאחר סדרת גירוי WU בודדת. עובדה המצביעה ככל הנראה, על ספציפיות לסוג הגירוי המכונן )גירוי חשמלי( שכן בזמן זה החיות לא הראו התנהגות כאב. לבסוף, לאחר שמצאנו כי מודל הניסוי )סדרת הגירויים( משפיע על מדדי כאב, בקשנו לבדוק האם חשיפה למודלים של כאב ידועים )'מודלים קליניים'( משפיעה על תגובת ה?WoW מצאנו כי לאחר גירויים נוסיספטיים, כגון גירויי חום, חתך בירך, או גירוי WU שבוע לפני בדיקת WoW התגובה לסדרת הגירוי הראשונה ( st 1( הגיעה למקסימום האפקט )הייתה מוגברת בדומה לתגובה שנצפית בדר"כ רק לסדרות הבאות(. מניסויים אלו למדנו כי גירויים נוסיספטים קודמים עשויים ליצור ריגוש מרכזי שמתבטא בתגובות מקסימליות כבר בתגובה לסדרת הגירוי הראשונה )כלומר, בשלוש סדרות הגירוי(. 7

לעומת זאת לא מצאנו שינוי בדפוס ה- WoW במודל כאב שמבוסס על חתך שטחי בכף הרגל. קיימים ככל הנראה שני הסברים מנגנוניים המבחינים בין מודל החתך לבין מודל ה-.WoW 1- מודל החתך מבוסס בעיקר על פעילות פריפרית, בעוד שמנגנון ה- WoW הינו מרכזי. 0- הקולטן המרכזי הפעיל בעקבות החתך בעור הינו,AMPA ואילו הקולטן המרכזי הפעיל ביצירת ושימור WoW הוא הקולטן מסוג.NMDA לסיכום: תופעת ה- WoW מראה כי סדרה של גירויים מכאיבים חוזרים בחיה נאיבית יוצרת ריגוש מרכזי אשר מתבטא ב WU מוגבר בתגובה לסדרות גירויים נוספות.(WoW) ההתאמה הגבוהה בין תגובות הרפלקס בשריר ובין סיבי עצב היורדים מחוט השדרה, כמו גם העליה ב perk לאחר גירוי,WU ביחד עם מעורבות אזורים סופרא-ספינאליים, מצביעים על כך שתהליך ה- WoW משקף תגובה מוגברת של מערכת העצבים המרכזית. בנוסף, גירוי WU בודד הביא לרגישות מוגברת לכאב שנמשכה לפחות 7 שעות. חסימת קולטני NMDA לפני סדרות הגירויים ביטלה,WoW וחסימת הקולטנים לאחר התפתחות ה- WoW הפחיתה, על אף שלא ביטלה לחלוטין, את תגובת ה.WU מצאנו כי ניתן ליצור WoW ע"י החלפת הסדרה הראשונה של גירוי חשמלי בגירויים מכאיבים 'טבעיים' המשרים ריגוש מרכזי. על סמך עובדות אלה אנו מציעים מודל לשימוש בתופעת ה- WoW ככלי להערכת מידת העוררות של רגישות מרכזית לכאב. 8

Abstract 1.1 Repetitive nociceptive stimulation of low-frequency (0.3-5 Hz) leads to a progressive increase in action potential output from dorsal horn neurons, a phenomenon known as temporal summation, or wind-up. Measurement of the nociceptive withdraw reflex (NWR) is a useful tool for the evaluation of wind-up. The reflex activity was found to be in high correlation with the activity of wide dynamic range neurons in the dorsal horn of the spinal cord. In the present study we found that the 1 st wind-up curve obtained from a naïve animal (i.e. without prior nociceptive stimulation) is linear and weaker compared to the saturation curves obtained in response to subsequent identical trains (2 nd and 3 rd ); a potentiation process that occurs during a 10 min inter-train interval. This finding is in contrast to earlier studies, in which wind-up protocols using a single noxious stimulus (to asses the duration of the WU effect), have reported that wind-up duration lasts for no more then tens of seconds. Indeed, the amplified response is not noticed on the first stimulus of each subsequent train (2 nd or 3 rd), but only on the whole train (20 stimulations). This led us to suggest that one can only appreciate the duration of a wind-up effect by an additional wind-up stimulation. We named this phenomenon Wind-up of Wind-up, or WoW. To our understanding, this phenomenon reflects the rapid transition in the CNS from a normal sensory state to heightened sensitivity, named central sensitization. The wind-up phenomenon has been studied intensively in the past. However, the wind-up amplification phenomenon as illustrated in the present study has not been previously observed, possibly because of different experimental conditions. The aim of this study was to characterize the mechanisms involved in WoW. We first evaluated the contribution of frequency and intensity stimulation parameters in WoW development. Frequency experiments: Using intensity sufficient to activate C-fibers, stimulation of 0.1Hz, a frequency which by itself does not produce wind-up, also did not produce wind-up or WoW in the present study. However, a 4 th train given at 1Hz generated an amplified wind-up response. These results show that strong stimulation, even at low frequencies, can induce hyper-sensitivity which is evident only following stimulation at the wind-up frequency range. Stimulations at 1Hz or 2Hz induced WoW in the established experimental protocol. Intensity experiments: Using a 1Hz frequency which is sufficient to produce wind up, intensities lower then the C fiber threshold did not produce wind-up or WoW. Moreover, administering a 4 th C-fiber 2

intensity train also did not produce augmented wind-up. The latter finding indicates that C-fiber activation is vital for the initiation of central sensitization. We next used a super-threshold stimulation (10mA). We hypothesized that as a result of a massive C-fiber activation, we would get a maximal saturation curve on the first train (a result we normally observe only in the 2 nd and 3 rd trains). However, the response showed the 'usual' WoW pattern, implying a fixed mechanism occurring in the minutes between the 1 st and the 2 nd trains. Following the electrical WoW parameters we asked: Does WoW augmentation take place in the periphery (muscle) or in the central nervous system (spinal cord)? Simultaneous recordings of EMG and sciatic nerve activity were found to be highly correlated (r=0.77). These data indicate that the measured EMG is a direct outcome of a spinal output rather than a muscular process. Can a single wind-up train increase perk, a marker for central sensitization, 10 min after stimulation? Stimulated animals showed a rise in positive cells for perk compared to zero staining in naive animals. Moreover, two inbred strains, which are different in their expression of the WoW phenomenon, expressed matching perk positive cells (i.e., higher perk in the higher WoW expressing strain). Is the brain involved in WoW and, if yes, how? Spinalization (at T 3-4) caused significant reduction in the 2 nd and 3 rd trains compared with the 1 st. This result indicates a supra-spinal amplifying influence during WoW. Does wind-up stimulation induce pain behavior? Wind-up is an electrophysiological phenomenon not previously studied behaviorally. Following wind-up stimulation (one train) mice exhibited tactile allodynia for at least 24h and thermal sensitivity for at least 48h. Additional trains (2 nd or 3 rd trains) did not produce a further increase in tactile or thermal sensitivity. The latter might suggest that the observed enhanced pain is the impact of the 1 st wind-up stimulation, while subsequent trains only reflect this effect without enhancing any further pain sensitivity. Does NMDAR blockade before WoW affect its development? NMDA receptors are known players in neuronal plasticity, memory and central sensitization. Blocking these receptors with MK-801, the non competitive antagonist, before stimulation, blocked wind-up and WoW. The result of this experiment suggests a fundamental role for NMDAR in WoW built-up. Does NMDAR blockade after WoW affect its development? Blocking NMDAR after the 2 nd train did not affect the response to the 3 rd train, but decreased the response to a 4 th train (40 min after MK- 801). These data suggest an important role for NMDAR in preserving WoW. 1/

Does NMDAR blockade affect pain behavior? MK-801 treatment 30 min before wind-up stimulation blocked tactile allodynia but not thermal sensitivity (7 h after stimulation). In addition, 7 days after stimulation, all three experimental groups (1-Sham-saline, 2-Windup-saline and 3-Windup-MK 801) were anesthetized and assessed in the established WoW protocol. The Shamsaline group exhibited the usual WoW curves; animals of the Windup-saline group showed potentiated WoW (already seen in the 1 st train); and the Windup-MK 801 group showed wind-up but no WoW. These findings suggest long term potentiation and modality specific effects for WU stimulation which could only be observed using the WoW stimulation paradigm. Blockade of the NMDA receptors during WU stimulation (conducted 7 days earlier) produced modality specific long term depression as revealed by the WoW paradigm. It is noteworthy that the effects revealed by the WoW paradigm a week after the original WU stimulation are observed despite the fact that no differences in pain sensitivity was observed among these experimental groups in behavioral tests conducted 3 days after the WU stimulation (i.e., 3 days before the WoW paradigm was administered). Are microglia cells involved in WoW? Microglia are active participants during central sensitization via pro-inflammatory cytokines released in the spinal cord. Treatment with the microglia inhibitor, minocycline (30 mg/kg X3 i.p. injections), decreased WoW significantly. Is endogenous interleukin-1 (IL-1) involved in WoW? Exogenous intrathecal injections of IL-1 are algogenic, causing thermal sensitivity and wind-up amplification. Therefore, in order to examine for endogenous IL-1 activity during WoW, we used acute systemic administration of IL-1 receptor antagonist (IL-1ra; 100mg or 200mg/kg, i.p.). Acute blockade of IL-1 signaling had no effect on WoW development. Does chronic blockade of CNS IL-1 signaling affect WoW behavior? A mutant strain of mice with a permanent impairment of IL-1 signaling in the CNS demonstrates similar WoW compared to its wild-type controls. These data rule out IL-1 involvement in WoW. Do prior natural noxious stimulations affect WoW? Three noxious thermal stimulations were given to anesthetized mice before WoW examination. To prevent tissue damage thermal stimulations were turned off when EMG withdrawal reflex was noticed. Following these stimuli the 1 st wind-up was already maximal, showing saturation curve. We concluded that WoW is not an electrical artifact as it can be mimicked or generated using thermal stimuli. In addition, WoW response may reflect a central sensitization state caused by prior thermal stimuli. A similar picture was seen following a priming incision in the skin and muscles of the thigh. Reflex recording during the act of incision revealed it as an intensive stimulation. Indeed the 1 st wind-up train, following such incision, was already maximal, showing saturation curve. These data are in accordance with the result of the thermal experiment described above. 11

In summary, the WoW phenomenon shows that a train of noxious stimulation (wind-up) can cause a state of central sensitization reflected in subsequent trains as an amplified windup response (WoW). The wind-up stimulation is accompanied by enhanced pain sensitivity. The high correlation of nervemuscle activity together with the rise of perk in the spinal cord support a central process. The fact that WoW is affected by prior 'natural' noxious stimuli suggests the use of the WoW protocol as a tool for the assessment of central sensitization. 10

2.0 תוכן עניינים: שלמי תודה... 4 0.1 תקציר:... 5 9... ABSTRACT 1.1 2.0 תוכן עניינים:... 01 1.0 רשימת איורים:... 05 1.1 מבוא:... 01 1.0 מסלול העברת הכאב:... 01 1.1 רגישות פריפרית - שינויים פלסטיים בנוסיספטורים:... 01 1.1 רגישות מרכזית SENSITIZATION...:CENTRAL 01 11...:LTP 1.4 פוטנציאציה ארוכת טווח POTENTIATION LONG TERM 1.1 1.5 תופעת ה...:WIND-UP 14 1.3 מעורבות תאי מיקרוגליה ואסטרוציטים בכאב:... 13 דלקת ורגישות נוסיספטורים פריפרית:... 13 אינטראקציות בגנגליונים תחושתיים:... 13 תגובת מערכת העצבים המרכזית לנזק פריפרי:... 11 11... :INTERLEUKINE-1 (IL-1) 1.1 מטרות המחקר הנוכחי:... 11 4.1 חומרים ושיטות:... 11 4.0 חיות:... 11 4.1 פרוטוקול גירוי ורישום...:WOW 11 4.1.0 ניתוח נתוני תגובות :WOW... 10 ניסוי רישום מקביל מהשריר )EMG( ומהעצב הסכיאטי )ניסוי 3.1.0(:... 11 ניסוי חיתוך חוט השדרה )ניסוי 3.1.1(:... 11 ניסוי גירוי תרמי מקדים ל WOW )ניסוי 3.3.0(:... 11 4.4 אימונוהיסטוכימיה: סימון PERK לאחר גירוי...WU 11 4.4.0 האם סדרת גירויים של WU יכולה להביא לעליה ב PERK 10 תוך דקות מהגירוי?... 11 11

4.5 מדידות התנהגותיות:... 14 4.5.0 רגישות למגע TEST(...)VON-FREY 15 4.5.1 רגישות לחום TEST( )HARGREAVES... 15 4.3 חומרים:... 15 4.1 ניתוח סטטיסטי:... 15 5.1 מודל ה ומודל ה...:WOW 11 14 WIND-UP 3.1 תוצאות:... 19 3.0 בדיקת פרמטרים... 19 3.0.0 3.0.1 השפעת תדירות הגירוי על יצירת ה- :WOW... 19 השפעת עוצמת הגירוי על יצירת ה- :WOW... 40 3.0.1 האם תהליך ההגברה מתפתח במרווח שבין הסדרות או כתלות במספר הגירויים?... 41 3.1 תהליך פריפרי או מרכזי?... 44 3.1.0 האם תופעת ה WOW שנרשמה בעבודה זו מקורה בשינויים שחלים בשריר או מקורה בשינויים בתגובה עצבית מרכזית?... 44 3.1.1 חיתוך עור ושרירי הירך מוביל לרמת גירוי דומה לסדרת WU ראשונה.... 43 3.1.1 חיתוך חוט שדרה ברמת בית החזה מביא לירידה בתגובות הרפלקס... 41 3.1.4 התאמה בין רמת התאים המבטאים PERK ליכולת לייצר.WOW... 50 3.1.3 השפעת חסימה מרכזית על יצירת...WOW 51 3.1.1 השפעת חסימה מרכזית על שימור...WOW 51 55... 3.1 התנהגות כאב בעקבות גירויי.WIND-UP 3.1.0 האם סדרות הגירויים משפיעות על התנהגות כאב?... 55 3.1.1 האם חסימת קולטני NMDA תשכך את התנהגות הכאב?... 51 3.1.1 בדיקת משך השפעת הגירויים על תגובות WOW לאחר 7 ימים מגירוי.WU... 59 IL-1 3.4.0 3.4 מעורבות תאי גליה בתהליך ה.WOW... 31 האם תאי מיקרוגליה מעורבים ביצירת ה?WOW... 31 3.5 האם הגברת ה WOW נובעת משחרור ופעילות אינטרלאוקין- 1 אנדוגני?... 30 3.5.0 האם חסימה ממושכת של במערכת העצבים משפיעה על יצירת ה...?WOW 31

3.3 האם גירויים נוסיספטים 'טבעיים' משפיעים על תגובת ה...?WOW 31 3.3.0 האם גירוי תרמי מקדים משפיע על דפוס ה...?WOW 31 3.3.1 האם טיפול מקדים במודל 'כאב לאחר ניתוח' MODEL( )BRENNAN משפיע על דפוס ה?WOW... 34 1.1 דיון:... 33 10... CONTENTS: 1.1 ביבליוגרפיה:... 11 1.0 רשימת איורים: איור 1 : סכמת יצירת perk ותהליכים ליצירת ושימור ריגוש מרכזי.... 01 איור 2: תיאור סכימטי של מערך הגירויים והתגובות במסלול קשת הרפלקס הנוסיספטי.... 11 איור 3: שיטת המדידה... 10 איור : 4 גירוי WU מביא תוך 10 דקות לעליה בביטוי.pERK... 14 איור 5: רמת ביטוי 01 perk איור : 6 תיאור סכמטי ודוגמה לרישום WoW דקות אחרי סדרת WU אחת.... 14 בחיה.... 17 איור : 7 גרף מייצג להתפתחות ההגברה הבין סדרתית-...WoW 18 איור : 8 סכמה של מהלך ניסוי השפעת התדירות.... 12 איור : 9 גירוי בתדירות נמוכה לא יוצר wind-up אך גורם לרגישות מרכזית... /4 איור : 10 השפעת תדירות הגירוי על דפוס ה-.WoW... /4 איור : 11 סכמה של מהלך ניסוי השפעת עוצמת הגירוי... 41 איור : 12 גירוי בעוצמה נמוכה )0.1mA( לא יוצר WU ולא...WoW 40 איור : 13 גירוי בעוצמה גבוהה בהרבה מהסף )X10T( יוצר את דפוס ה- WoW... 40 איור 01: תהליך ההגברה תלוי בזמן בין הגירויים ולא במספר הגירויים.... 41 איור : 15 איור סכמטי המתאר את אופן ניתוק הסיבים מהפריפריה ושמירתם מחוברים למרכז... 44 איור : 16 התאמה גבוהה בין פעילות שריר-עצב... 45 איור 17 איור 18 : תגובות השריר והעצב בפרוטוקול ה.WoW... 45 : סכמת מהלך ניסוי החתך בעור ושרירי הירך.... 46 איור : 19 השפעת חיתוך מקדים של עור ושריר ירך על...WoW 47 איור : 20 סכמת מהלך ניסוי הפרדת חוט השדרה מהמוח... 48 איור : 21 חיתוך חוט שדרה ברמת בית החזה מביא להפחתה משמעותית בתגובות WU ו.WoW... 42 איור : 22 רישומים מקוריים של סדרות גירוי לאחר ניתוק המוח... /5 איור : 23 רמת ביטוי perk בהתאמה עם רמת WoW בשני הזנים... 51 איור : 24 חסימת קולטני NMDA מונעת WU ו-.WoW... 50 15

איור : 25 חסימת רצפטורי NMDA אחרי התפתחות...WU 54 איור : 26 סכמת מהלך ניסוי ההשפעה ההתנהגותית של גירוי...wind-up 55 איור : 27 סדרת גירויי wind-up גורמת להתנהגות כאב... 56 איור : 28 סכמת מהלך ניסוי השפעת MK-801 על התנהגות כאב בעקבות גירוי...Wind-up 57 איור 29 : טיפול בחסם NMDA מנע רגישות למגע אך לא לחום.... 58 איור : 30 התגובות המוגברות נשמרות שבוע אחרי הגירוי.... 52 איור : 31 סכמת מהלך ניסוי השפעת מינוציקלין על...WoW /6 איור : 32 טיפול מקדים עם מינוציקלין לא מנע אך הפחית WoW באופן משמעותי.... 61 איור : 33 מתן IL-1ra סיסטמי לא מפחית תגובות...WoW 60 איור : 34 חסימה מרכזית כרונית של IL-1 לא מפחיתה תגובת.WoW... 61 איור : 35 גירוי חום מקדים יוצר תגובת WoW כבר לגירוי החשמלי הראשון... 64 איור 33: סכמת מהלך ניסוי השפעת חתך בכף הרגל על.WoW... 65 איור 33: חתך בכף הרגל אינו משפיע על דפוס ה-.WoW... 65 איור 33: שימוש ב- WoW לבדיקת רגישות מרכזית.... 76 איור 33: אלגוריתם לאבחנת רמת רגישות מרכזית בעזרת 77...WoW 16

1.1 מבוא: כאב אקוטי מתרחש בעקבות חשיפה לגירוי מזיק )noxious( ומשמש כסימן אזהרה לפני או במהלך נזק לרקמה. התגובה לגירוי מזיק מסוים אינה אחידה אלא תלויה במספר תהליכים שעשויים להגביר או לדכא אותה ]1[. מנגנון אחד של הגברת כאב הינו 'פלסטיות עצבית' plasticity( )neural במערכת העצבים המרכזית.)CNS( בהקשר זה פלסטיות עצבית מוגדרת כתהליך שבו נוירונים המעורבים בהעברת אותות נוסיספטיים עוברים שינוי ממצב רגישות נורמלי )normosensitive( למצב רגישות גבוהה )hypersensitive( ]1, 0[. רגישות גבוהה מתבטאת בתחושת כאב בעקבות גירויים שבאופן נורמלי אינם מכאיבים )אלודיניה( ו 0 או תחושת כאב מוגברת לאחר גירוי מכאיב )היפראלגסיה(. הבנת מנגנונים של תופעות אלו עשויה להבהיר חלק מתהליכי בקרת הכאב. לשם כך פיתחנו מודל לחקירת תהליכי ריגוש מרכזי אשר מבוסס על סדרות גירויי wind-up )יתואר בהמשך(. בהמשך בדקנו את המעורבות של תאי גליה בתהליכי הריגוש המרכזי שנצפו במחקר זה. ידוע כי תאי גליה, וביניהם אסטרוציטים ומיקרוגליה, הינם בעלי חשיבות רבה בכל הנוגע לשמירת הומיאוסטזיס במערכת העצבים. ככל הנראה, נזק לרקמה והפעלה אינטנסיבית של מסלולי כאב מביאים לשחרור מתווכי דלקת )ציטוקינים פרואינפלמטוריים( בפריפריה ובמערכת העצבים המרכזית ]1, 4[. קישור ציטוקינים כדוגמת אינטרלאוקין- 1 )IL-1( לרצפטורים על פני הממברנה של תאי גליה מביא להפעלת תאים אלו באופן שעשוי להשפיע על תהליכים עצביים כמו פלסטיות עצבית וריגוש מרכזי ]4[. התוצאה הסופית של שרשרת אירועים אלו היא תגובת כאב מוגברת. 1.0 מסלול העברת הכאב: כאב פיסיולוגי הינו מנגנון הגנה הכרחי אשר מתריע על נוכחות גירוי מזיק בסביבה. כל היצורים החיים חייבים להיות מסוגלים להגיב לגירוי מזיק ונראה שבמהלך האבולוציה התפתחה מערכת עצבים פלסטית בעלת יכולת לזהות ולזכור סכנה ]5, 6[. נזק לרקמה מפעיל את המערכת הנוסיספטית שמעבדת את המידע על הגירוי המכאיב, מקודדת אותו לפעילות עצבית, שמועברת למערכת העצבים המרכזית שם היא נחווית כתחושת כאב. לכאב תפקיד הגנתי שעוזר למנוע נזק לרקמה ע"י יצירת רפלקס רתיעה מהגורם המזיק, וכן תפקיד למידתי שמטרתו הימנעות ממגע עתידי עם הגורם המכאיב ]7[. היכולת של אורגניזם לשנות התנהגות בעקבות התנסות קודמת מעלה את יכולתו לשרוד )תהליך למידה(. כאשר חיה )כולל אדם( חווה סיטואציה מסוימת או פעילות מסוימת מלווה בתחושת כאב, קיים סיכוי גבוה שבעתיד היא תמנע מסיטואציה או פעילות זו. כאב פיסיולוגי מתחיל בהפעלת סיבים נוסיספטורים המעצבבים רקמות פריפריאליות. נוסיספטורים אלו מופעלים רק ע"י גירויים מעל עצמה מסוימת היכולים ליצור נזק לרקמה. גירויים מכאיבים נקלטים בקצות העצבים ומפעילים באופן ספציפי קולטנים מצומדים לתעלות יוניות המחוללים זרמי דפולריזציה ]8[. לדוגמה, קולטנים המופעלים ע"י כימיקלים מגרים ממקור חיצוני או פנימי לגוף, כגון,VR1, DRASIC, P2X3 או קולטנים לגירויי חום כגון VR1 ו-,VRL1 מבוטאים סלקטיבית בנוירונים תחושתיים ]0[. במידה ונוצר זרם מעורר מספיק חזק ייווצר פוטנציאל פעולה והשדר התחושתי שנוצר בנוסיספטורים יועבר לחוט השדרה )מערכת העצבים המרכזית- )CNS ויפעיל נוירונים שדרתיים באמצעות שחרור נוירוטרנמיטרים בסינפסה ]8[. הנוירוטרנסמיטר המעורר )excitatory( העיקרי בסינפסה הינו גלוטמט אשר מפעיל תעלת )α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid( AMPA ובנוסף תעלת.kainate התהליכים המעוררים בחוט השדרה עוברים בקרה ע"י נוירונים מעכבים מאותו סגמנט או מפקודות היורדות מהמוח. הנוירוטרנסמיטרים המעכבים הם גליצין )glycine( ו- )γ-aminobutiric acid( GABA ]0, 2, /1[. הנוירונים השניוניים שבחוט השדרה מפעילים רפלקס רתיעה שדרתי ובו בזמן מעבירים את המידע הנוסיספטי אל המוח ]0[. תופעה חשובה נוספת אשר מגבירה 17

את הפעילות ההגנתית של תחושת כאב היא ריגוש )או עוררות )sensitization של המערכת הנוסיספטית. תהליך זה קורה בעקבות גירוי אינטנסיבי ו 0 או רפטטיבי שגורם לירידה בסף ההפעלה ולהגברת התגובה לקלט חדש, אפילו תת-סיפי. בהיעדר גירוי מזיק נוסף לאזור המגורה, מצב זה של רגישות מוגברת ישוב לאחר זמן לרמתו הבסיסית, שבו שוב יידרש גירוי אינטנסיבי )על-סיפי( על מנת לגרום לכאב ]7[. 1.1 רגישות פריפרית - שינויים פלסטיים בנוסיספטורים: הפעלת נוסיספטורים יכולה ליצור שינויים בפעילות שלהם. לשינויים כאלו ניתן השם activity-dependent plasticity )פלסטיות בעקבות פעילות( והם באים לידי ביטוי בהגברת תגובות המערכת לגירויים חוזרים. שינוי מסוג זה מתרחש כאשר סף ההפעלה הגבוה של קצות הנוסיספטורים עשוי להשתנות לסף נמוך, בעקבות שינוי בקולטנים או בגלל עליה כללית בעוררות הממברנלית בקצה הנוסיספטור. דוגמה לשינוי בקולטן: גירויי חום או שימוש בקפסאיצין עשויים להביא לשינוי בפעילות קולטני ה- Vanilloid דבר המוביל לירידה בסף ועליה בתגובה לגירויי חום נוספים ]11[. שינויים אלו מתרחשים במהירות, אך גם הפיכים תוך זמן קצר ומייצגים ככל הנראה שינוי במבנה החלבון )הקולטן( המושרה ע"י חום ]8[. מנגנון נוסף קשור להגברה באקסיטביליות הממברנלית בקצה הנוסיספטור שמובילה לירידה ברמת הדפולריזציה הדרושה לחולל פוטנציאל פעולה. תהליך כזה מתרחש לדוגמה בעת גירוי הנוסיספטור ע"י חומרים דלקתיים ( 5-HT, PGE2, )bradykinin, adenosine, cytokines המשתחררים בעת נזק רקמתי ]10, 11[. השינויים המתרחשים בנוסיספטור הם תוצאה של פעילות קינאזות תוך תאיות kinases( )intracellular שגורמות לשרשרת זירחונים )ע"י,tyrosine kinase )PKC,PKA של תעלות יוניות ]14, 15[. התוצאה הסופית היא ירידה בסף ההפעלה של התעלות היוניות, שינוי ביחס שבין תקופות הפעלה 0 חוסר הפעלה, והגדלת זרמי הנתרן לדפולריזציה ]0[. לסיכום, שינויים בקולטן מובילים לעליה ברגישות ספציפית לסוג הגירוי המפעיל )הספציפי לקולטן(, ואילו שינויים המתרחשים בעקבות הגברה באקסיטביליות הממברנלית אינם ספציפיים וגירויים מסוגים שונים יחוללו ירידה בסף והגברה בתגובות. 1.1 רגישות מרכזית sensitization :Central הארגון העולמי לחקר הכאב ( of The task force for taxonomy of the International Association for the Study )Pain- IASP הגדיר 'ריגוש מרכזי' )או 'רגישות מרכזית'( כ "תגובה מוגברת של נוירונים נוסיספטים במערכת העצבים המרכזית לקלט אפרנטי נורמלי או תת-ספי. " Increased responsiveness of nociceptive neurons in the central.nervous system to their normal or subthreshold afferent input" במקביל, ריגוש מרכזי sensitization( )central מוגדר בספרות המקצועית באופנים שונים והגדרתו נתונה ולדיון מתמשך ]16[. הגדרת מושג הרגישות מרכזית הינה מורכבת משום שהיא עוסקת במרכיבים שונים של התופעה, החל בטריגר המספיק כדי ליצור רגישות מרכזית, המשך במנגנון התפתחות התופעה מבחינת סוג ומיקום הנוירונים הפעילים בה, כמו גם התהליכים הביוכימיים שבתאים, המולקולות המשתתפות בתהליכים אלה, ולבסוף בתוצאה הסופית של רגישות מרכזית שהיא מכלול התופעות ההתנהגותיות הנגזרות ממצב זה. בחלק ניכר מהפרסומים משתמשים בהגדרה כללית לביטוי 'ריגוש מרכזי' כמכלול השינויים במערכת העצבים המרכזית אשר מובילים לתגובות ותחושות כאב מוגברות לאורך זמן; במספר פרסומים אחרים ישנו ניסיון להגדיר את התופעה בעזרת מדדים מוגדרים יותר ]17[. הצטברות הידע בשנים האחרונות בנוגע לתפקידי תאי 18

הגליה השונים, פעילות אזורי בקרה מוחיים ופעילות מערכת החיסון במסלולי הכאב רק מוסיפים על מורכבות התופעה והגדרתה. בפרק זה אנסה לסכם את מהלך השלבים בתהליך יצירת הרגישות המרכזית )טריגר, מנגנון התפתחות, ותוצאה סופית( כפי שתוארו בשלושים השנים הקודמות. אתחיל בהשלכות של רגישות מרכזית, אמשיך במנגנון התפתחותה, ובפרקים הבאים, אציג סוגי טריגרים נוסיספטים המשמשים בחקר התופעה. מבחינת התוצאה הסופית של ריגוש מרכזי מקובלים כיום מספר מאפיינים עיקריים ]1, 18[: תגובה מוגברת של הנוירונים שבקרן הדורסלית לגירוי נוסיספטי )על-סיפי(. 1( הגדלה בשדה הרצפטיבי בעור- אלודיניה משנית. 0( ירידה בסף הגירוי. 1( משך זמן התופעה נע בין דקות לשעות במודלים ניסויים, ואף שנים במצבי כאב כרוניים פתולוגיים בבני אדם. 4( מאפיינים אלו מהווים מעיין אבן בוחן לקביעה האם מודל ניסויי מסוים מקיים אחד או יותר מהמאפיינים של רגישות מרכזית. רגישות מרכזית כוללת שני שלבים עיקריים כל אחד בעל מנגנון משלו. השלב המוקדם מתרחש מיד עם השריית הגירוי הנוסיספטי; שלב זה נגרם בעיקר בעקבות הפעלת קולטנים של גלוטמט ובהמשך הוא כרוך בתהליכי זירחון תוך תאיים ושינוי בפעילות תעלות יוניות. השלב המאוחר תלוי בשעתוק גנים וייצור חלבונים חדשים האחראיים לשימור התופעה לאורך זמן והוא מאפיין מצבים פתולוגיים ]18[. סוגים שונים של גירויים נוסיספטים )חשמלי 0 כימי 0 מכני 0 דלקתי 0 תרמי( מובילים לשינויים בתגובות הנוירונים המרכזיים. יחד עם זאת, כדי להשרות רגישות מרכזית, הגירוי המזיק חייב להיות אינטנסיבי, רפטטיבי וממושך. יש צורך בקלט ממספר רב של סיבים לאורך עשרות שניות. גירוי בודד כמו דקירת מחט אינו מספיק. אין הכרח בנזק רקמתי פריפרי, למרות שגירוי מזיק הפוגע ברקמה, כמעט תמיד יגרום לרגישות מרכזית ]18[. מנגנון השלב המוקדם של רגישות מרכזית: גלוטמט, הנוירוטרנסמיטר העיקרי המופרש מהנוסיספטורים בקרן הדורסלית נקשר בצד הפוסט סינפטי לקולטנים מסוג: ionotropic amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole ( AMPA G( בנוסף לקולטנים מטבוטרופים )מצומדי חלבון,kainite ו- )N-methyl-D-Aspartate( NMDA,)propionate המכונים באופן כללי.mGluR תחת תנאים רגילים תעלת ה NMDA חסומה ע"י יון מגנסיום ( +2 )Mg ]12, /0[. שחרור ממושך של גלוטמט מהנוסיספטורים יחד עם נוירופפטידים נוספים, substance P וכן,CGRP מוביל לדה-פולריזציה ממברנלית שגורמת ליון המגנסיום לצאת מתעלת ה.NMDA קישור של גלוטמט לקולטן ה NMDA לאחר הסרת חסימת המגנסיום מביא להגברה מהירה של היעילות הסינפטית וגם לכניסת סידן ( +2 )Ca לנוירון, ובהמשך מוביל להפעלת תהליכים תוך תאיים רבים התורמים לשימור הרגישות המרכזית ]12, /0[. קישור של גלוטמט לקולטני mglur group I תורם אף הוא ליצירת הרגישות המרכזית ע"י שחרור סידן ממאגרים תוך תאיים מהממברנה האנדופלסמטית. הנוירופפטיד substance P המופרש מהנוסיספטורים נקשר לקולטן neurokinin-1 G-protein coupled ( NK1 )receptor גורם לדה-פולריזציה ארוכה ]01[ ובכך תורם לסכימה בזמן summation( )temporal ]00-04[ בעת גירוי רפטטבי של סיבי C. 12

הנוירופפטיד )calcitonin gene-related peptide( CGRP המופרש מהנוסיספטורים מגביר את האפקט של substance P ]05[ ע"י קישר לקולטן CGRP1 המפעיל פוספטזות תוך תאיות מסוג PKA ו- ]06, PKC 07[. בנוסף, CGRP מגביר שחרור )brain-derived neurotrophic factor( BDNF מקצות הנוסיספטורים ]08[. BDNF הינו מודולטור סינפטי המשוחרר בחוט השדרה כתלות במידת הפעלת הנוסיספטורים ]02-11[. כאשר BDNF נקשר לקולטן trkb הוא מגביר את פעילות קולטני ה ]10, NMDA 11[ וגורם להפעלת מסלולי העברת אותות הכוללים את extracellular signal-( ERK.]14,10[ PKC )regulated kinases המתווך הדלקתי bradykinin מיוצר בחוט השדרה בתגובה לגירוי פריפרי אינטנסיבי מזיק ופועל דרך קולטן B2 )מצומד חלבון )Gq אשר מבוטא בנוירונים בקרן הדורסלית ]15[, ובכך דוחף לחיזוק סינפטי ע"י הפעלת מסלולי הזירחון,PKC PKA ו- ]16[. ERK לסיכום הטריגרים לרגישות מרכזית: בעקבות שטף פעילות בנוסיספטור, משוחררים בקצה הפרה- סינפטי גלוטמט אשר נקשר בקצה הפוסט-סינפטי לקולטני NMDA,AMPA ו- ; mglur במקביל, משוחררים פפטידים נוספים, דוגמת CGRP,substance P ו- BDNF שנקשרים לקולטני CGRP1,NK1 ו- TrkB בהתאמה. קולטני B2 מופעלים ע"י ברדיקינין המשוחרר בחוט השדרה. מסלולי העברת אותות תוך תאיים המתרחשים בשלב המוקדם של רגישות מרכזית: עלייה חדה ברמת הסידן התוך +2 Ca תאי מעבר לסף מסוים היא ככל הנראה גורם המפתח שמחולל רגישות מרכזית. חדירת שטף סידן דרך קולטני ה NMDA היא הדרך החשובה ביותר לאתחול השלב המוקדם ]17[. יחד עם זאת, קיימים מסלולים נוספים לחדירת סידן והם - תעלות AMPA חדירות לסידן ]18, 12[, תעלות סידן תלויות מתח ]/4[, כמו גם שחרור ממאגרים תוך תאיים בתגובה להפעלת חלבונים מטבוטרופיים ]41, 40[. רמת סידן תאית גבוהה מביאה לשפעול אנזימים מזרחנים המכונים קינאזות PKC ו- protein kinase ו- calcium-calmodulin-dependent protein kinase II ו- protein kinase C( PKA ו- CaMKII A(. זירחון קולטני AMPA ו- NMDA ]41, 44[ משנה את פעילותם )לדוגמה: מפחית את החסימה של יון המגנסיום ובכך מעלה את הסבירות לפתיחה ומוליכות התעלה( ואת תנועתם אל הממברנה ]45[, ומונע את כניסתם חזרה לציטופלסמה )אנדוציטוזה( כדי להעלות את צפיפותם הממברנלית ]45-47[. במקביל, פעילות PKC גורמת להפחתת פעילות אינהיביטורית ע"י GABA או גליצין ]48, 42[, כמו גם הפחתה במסלולים מעכבים היורדים אל חוט השדרה מה periaqueductal ( PAG )grey ]/5[. ביטול אינהיביציה מותירה את הנוירונים בקרן הדורסלית זמינים יותר להפעלה מקלט מעורר, כולל מנוירונים שאינם נוסיספטים )סיבים מסוג,)Aβ מנגנון קריטי התורם לקליטת גירויים ושימור הרגישות המרכזית ]51-51[. בנוסף, הפעלת הקינזות של מסלול )phosphlypase )C PLC/PKC מביאה לשחרור נוסף של סידן מהמאגרים התוך תאיים של הממברנה האנדופלסמטית reticulum( )endoplasmic ע"י.]54[ mglur הפעלת מסלול PI 3 K )phosphatidylinositol-3-kinase( ]55[ ומסלול )mitogen-activated protein kinase( MAPK מביאים לזרחון והפעלת גם )extracellular signal-regulated kinases( ERK וגם camp response element binding ( CREB )protein ]56[. המסלולים השונים הגורמים לזרחון והפעלת ERK מתרחשים בקרן הדורסלית בתוך דקות מרגע הגירוי הפריפרי ]57[. כיום ידוע כי נוכחות ERK מזורחן מסמן את האזורים האנטומיים בהם נמצאים נוירונים ששופעל בהם מסלול העברת האותות ע"י נוסיספטורים והם עוברים שינויים סינפטיים המבססים את הרגישות המרכזית ]14[. בחוט השדרה ERK מופעל בנוירונים רק בעקבות גירוי פריפרי בעוצמה המספיקה להשרות רגישות מרכזית ]57[. נוכחות ERK מזורחן משמשת סמן אימונוהיסטוכימי לרגישות מרכזית המועדף כיום על פני הסמן c-fos המופעל גם בעקבות גירויים בעוצמה נמוכה שאינם מספיקים להשריית ריגוש מרכזי ]58[. 0/

איור 1 : סכמת יצירת perk ותהליכים ליצירת ושימור ריגוש מרכזי. )הועתק מתוך.)Ref 58 מרגע שזורחן והופעל ERK פועל במספר דרכים לשימור הרגישות המרכזית ]56[ כפי שמוצג באיור 1. דרך אחת בפעולתו הוא זרחון תת היחידה NR1 של קולטן ה ]52[, NMDA ובמקביל גיוס קולטני AMPA נוספים אל הממברנה הפוסט- סינפטית ]/6[. מנגנונים אלה מובילים להגברת הזרמים דרך שני סוגי הקולטנים וכך מאיצים את יעילות הסינפסה ]16[. בנוסף, ERK מפחית זרמי אשלגן ( + K( ע"י זרחון תעלות אשלגן מסוג Kv4.2 דבר המגביר את האקסיטביליות הממברנלית ]61[. שינויים בשעתוק גנים מתווכים ע"י CREB כמו גם ע"י גורמי שיעתוק נוספים, שמביאים לביטוי גנים כמו,c-Fos.]56[ Cox-2 ו- TrkB,NK1 סיכום השלב המוקדם של רגישות מרכזית: שלב זה מושרה בשניות ע"י גירוי אקוטי רפטטיבי או גירוי ממושך של קלט נוסיספטי. הוא מאופיין בהגברה מהירה בפעילות הסינפסות של גלוטמט בקרן הדורסלית המחזקת את ההולכה הנוסיספטית. גיוס קולטנים נוספים מאפשר עליה ברגישות לגירוי וזירחונם משנה את קינטיקת הפעלתם )תלוית המתח( ואלה מוסיפים לירידה בסף הגירוי ועליה בתגובה. במקביל להפעלת קולטני גלוטמט פועלים הקולטנים ל-,BDNF,CGRP,substance P ברדיקינין ועוד להגברת האקסיטביליות הממברנלית. חשוב לציין כי המסלולים שתוארו פועלים במקביל ומצטלבים במספר צמתים עבור כל שלב בבניית רמת סידן, שרשרת הזירחונים, והפעלת מסלולי השיעתוק. אי לכך התהליך אינו תלוי במנגנון אחד, אלא מספר רב של מסלולים מקבילים היכולים לפעול בנפרד או בשיתוף על מנת ליצור רגישות מרכזית. מסקנה זו מתקשרת אל בעיית הגדרת הרגישות המרכזית שתוארה בתחילת פרק זה. יחד עם זאת, שלושה סממנים פנוטיפים חשובים עשויים לייצג את השלב המוקדם של רגישות מרכזית: 1- הגברה של העוררות הממברנלית, 0- חיזוק סינפטי, ו- 1- הפחתה בהשפעות המעכבות על הקרן הדורסלית. השלב המוקדם עשוי להמשך עשרות דקות או מספר שעות )בהעדר קלט גירויים נוסף( היות שהשינויים המתוארים הינם הפיכים. ללא טריגר נוסיספטי מתמשך פעילות הקינאזות תפסק ותחל פעילות פוספאטזות אשר יסירו את הזירחונים 01

מהקולטנים שכתוצאה מכך ישובו לרמת פעילותם הבזאלית. בנוסף, תחדל תנועת הקולטנים אל הממברנה ויחל תהליך הפוך של אנדוציטוסיס ]60, 61[. שימור הרגישות המרכזית לאורך זמן דרוש שלב נוסף, שלב השעתוק. שלב זה, ככל הנראה, לא מתרחש בעקבות הפעלה נוסיספטית קצרה אלא דורש נזק רקמתי כמו דלקת או פגיעה עצבית. במקרים כאלו, באופן תיאורטי, גירוי פריפרי ממושך מפעיל ומשמר את התהליכים המרכזיים זמן ארוך מספיק עבור ביטוי גנים לייצור חלבונים המשמרים את הרגישות גם בהיעדר קלט פריפרי ]64[. 1.4 פוטנציאציה ארוכת טווח potentiation :LTP long term פוטנציאציה ארוכת טווח או LTP הינה תופעה אלקטרופיסיולוגית שנתגלתה בשנים ]65, 1266-1271 66[ בהיפוקמפוס במוח. החוקרים מצאו כי גירוי חשמלי באיזור זה בתדירות גבוהה HFS( )100Hz High Frequency Stimulation; גרם להגברה ביעילות ההולכה הסינפטית למשך שעות. תופעה זו תוארה כפוטנציאציה סינפטית ארוכת טווח ;)LTP( בהמשך נמצא כי ניתן באופן גירוי שונה )גירוי ממושך בתדירות נמוכה( להפחית הולכה סינפטית למשך זמן ארוך, תופעה שכונתה LTD(.)long term depression; שימוש בתופעות ה LTP ו- LTD נפוץ על מנת להדגים ולחקור פלסטיות סינפטית והן מהוות מודל מרכזי לשמירת מידע ב ]67[. CNS תופעות אלו נבחנו והודגמו גם בעצבים הסנסורים המגיעים אל חוט השדרה ]68, 62[, והן מחזקות את הרעיון שייצור LTP במסלולי כאב עשוי להוות מנגנון עבור 'זיכרון לכאב'. מנגנון כזה עשוי לספק הסבר לשאלה כיצד כאב אקוטי הופך לכרוני.]71,7/,67,17[ בחוט השדרה LTP הודגם באזורים שונים בשימוש בשיטות שונות, לדוגמא: רישום חוץ תאי מהשכבות השטחיות שבקרן הדורסלית או מהקרן הונטרלית ]62[, רישום מתאי (WDR( wide dynamic range שבשכבות העמוקות של הקרן הדורסלית ]70[, ורישום תוך תאי clamp( )patch מנוירונים בשכבות השטחיות שבקרן הדורסלית ]71[. מניסויים אלו אכן נראה כי תופעת ה LTP יכולה להוות מנגנון המסביר היפראלגסיה ]67[ ואף רגישות מרכזית ]74[. רוב המידע בנוגע ל LTP בשכבות השטחיות של הקרן הדורסלית מגיע מקבוצת המחקר של Jürgen Sandkühler ועמיתיו מגרמניה ואוסטריה. מחקר ה LTP מהשכבות העמוקות מתאי ה WDR נעשה בקבוצת המחקר הנורווגית ע"י החוקרים.Lars Jørgen Rygh, Frode Svendsen, Arne Tjølsen ישנה חשיבות לדיון בשתי קבוצות מחקר אלה משום שכל אחת מהן מדגישה את משמעות המסלול הנוסיספטי שבמרכז מחקרה ליצירת LTP במסלולי הכאב. משום שבמחקרי השתמשתי בשיטת ה wind-up המבוססת על פעילות תאי ה WDR מצאתי כי מחקרי הקבוצה הנורווגית רלוונטיים יותר לעבודתי. פלסטיות סינפטית ו- LTP בשכבות השטחיות של הקרן הדורסלית: בשכבות אלו עיקר התאים הינם תאי -NS,nociceptive specific כלומר תאים המגיבים לגירויים בעוצמה חזקה בלבד. בניסויים אלו, גירוי חשמלי רפטטיבי בתדירות גבוהה של העצב הסכיאטי השרה LTP בסינפסות של סיבי Aδ וסיבי ]75, C 76[, גם ברקמה מבודדת )in-vitro( וגם בחיה.)in-vivo( יתרה מכך, 'גירויים טבעיים' חזקים כמו כוויות בעור, חבלות, דלקת, ופגיעה עצבית, יצרו LTP בלמינה השנייה )היכן שרוב קצות סיבי ה- C מסתיימים( של חוט שדרה מנותק מהמוח )אך לא בחוט שדרה שלם( ]77[. נתגלה כי יש צורך בהפעלה במקביל של מספר קולטנים בממברנה הפוססינפטית, דוגמת- Substance-P,NK-1,NMDA ו-,mGlu כדי להשרות.LTP משך הזמן של התופעה תלוי בסוג הגירוי ונמצא ביחס ישיר לעוצמת הגירוי, וכן ברמת הפעילות היורדת מגזע המוח ]62, 78[. 76, לדוגמה, גירוי HFS בעוצמה המפעילה סיבי Aβ לא גרם ל,LTP לעומת זאת גירוי בעוצמה שמפעילה סיבי Aδ גרם דווקא ל LTD בחיה עם חוט שדרה שלם, אך ל LTP בחיה עם חוט שדרה חתוך ]75[. רק גירוי בעוצמה 00

המפעילה סיבי C יצר LTP בשכבות החיצוניות של חוט השדרה. לסיכום, השוואה בין LTP בחוט השדרה לבין היפראלגסיה בעקבות נזק רקמתי מעלה נקודות משיקות רבות הן מבחינת מסלולי מעבר אותות, מהלך הזמנים והפרופיל הפרמקולוגי אשר תומך ב LTP כמודל אטרקטיבי להסביר רגישות מרכזית המושרית ע"י נזק רקמתי. פלסטיות סינפטית ו- LTP בשכבות העמוקות של הקרן הדורסלית- תאי :WDR השכבות העמוקות שבקרן הדורסלית )שכבות 4-6 או )lamina IV-VI מורכבות בעיקר מתאי WDR )בניגוד להרכב השכבות השטחיות שרובן מתאי.)NS תפקידם של תאי ה )wide dynamic range( WDR בתהליכי עיבוד נוסיספטי עוד מצוי בדיון אך יחד עם זאת מוסכם כי לתאים אלו תפקיד חשוב בהעברת קלט מכאיב. ביכולתם של תאי ה WDR לפעול בעקבות קשת גירויים - מחלשים ועד חזקים stimuli( )noxious and innocuous ]72, /8[. המידע מתאים אלו מגיע לאזורים רבים בגזע המוח האחראיים על בקרת מסלולי כאב ]/8[. בנוסף, תאים אלו מעורבים באתחול התגובה המוטורית המושרית ע"י גירוי נוסיספטי )תגובת הרפלקס הנוסיספטי(. ניתן להדגים את המאפיינים העיקריים של LTP ברישום מתאי WDR לאחר גירוי סיבי ]70, C 81[. גירוי HFS בעצב הסכיאטי משרה הגברה בתגובות לגירויי חום בסיבי C למשך 6 שעות ]70[. יתרה מכך, חסימת קולטני AMPA ו- NMDA חסמה את יצירת ה ]80[. LTP חסימת קולטני ה NMDA לאחר יצירת LTP הפחיתה ב %/8 את הפוטנציאציה ]81[, בעוד ששימוש בחסם AMPA או הפעלת קולטן אופיאטי מסוג μ לא פגעו בהגברה הסינפטית ]81, 84[. מדידת נוזלי CSF מחוט השדרה הראתה כי קיים שחרור של Substance-P במהלך הגירוי אך לא לאחריו. דבר המצביע על פעילות Substance-P והקולטן שלו NK-1 במהלך השריית ה LTP בתאי ה.WDR עובדות אלו מראות כי בדומה ל LTP בשכבות השטחיות של חוט השדרה, הפעלה במקביל של הקולטנים היונוטרופים של גלוטמט - NMDA ו- - AMPA בנוסף ל NK-1 חיונית ליצירת LTP בתאי ה.WDR בניסויי ניתוק הפיך של חוט שדרה נתגלתה מעורבות חשובה של אזורים סופרא-ספינליים ]85[. בדיקות התנהגותיות בחיות ערות לאחר גירויי HFS הראו רגישות גבוהה לחום במבחן hot-plate ברגל המגורה וגם ברגל הקונטרא-לטרלית ]86[. מדידות פיזור משקל שנעשו בחיות אלו הראו כי לעומת קבוצת ביקורת,)sham( החיות המגורות מפחיתות משקל באופן משמעותי מהרגל המגורה )ונשענות על הרגל ללא הגירוי( למשך 48 שעות. אולם, במידה ולפני הגירוי החיות טופלו בחומר משתק שרירים )פנקורוניום ברומיד( לא נראה שינוי בפיזור המשקל למרות הגירוי. עובדה אחרונה זו מעידה ככל הנראה כי גירוי ה- HFS יוצר הפעלה שרירית אינטנסיבית מתבטאת בהתנהגות כאב אופיינית ואין ברגישות המרכזית לבדה ליצור את השינוי ההתנהגותי הנמדד. לסיכום, LTP )בעקבות גירוי בתדירות גבוהה( במסלולי הכאב עשוי להוות הסבר אטרקטיבי לתהליך המתרחש בקרב חלק מהאנשים שסובלים מכאב - תהליך בו כאב אקוטי מתקבע והופך לכרוני. פוטנציאציה ארוכת טווח )LTP( בעקבות גירוי בתדירות נמוכה: דלקת ברקמה פריפרית גורמת לכאב ספונטני והיפראלגסיה. הכאב הדלקתי נגרם בין היתר מהגברת הקלט הנוסיספטי בשכבות השטחיות של חוט השדרה. בתהליך הדלקתי משוחררים נוירומודולטורים כגון Substance-P וגלוטמט בקרן הדורסלית המובילים לעליה חדה ברמות הסידן ( 2+ )Ca הפוסט סינפטי הדרוש להיווצרות.LTP הדרך המקובלת ליצירת LTP במחקרים העוסקים בתופעה היא בשימוש בתדירות גירוי גבוהה- 100Hz בעצבים אפרנטים כפי שתואר בסעיפים הקודמים. אולם תדירות גבוהה כזו אינה תדירות הירי הפיסיולוגית האופיינית לסיבי C בעת דלקת או טראומה אחרת. תדירות הירי המקובלת לסיבים אלו בדלקת היא בסביבות -1 ]87-82[, 10Hz לאחר טיפול עם הציטוקין IL-1β נמדדה תדירות ירי בטווח שבין ]/2[ 1-6Hz או לאחר נזק נוירופתי -0.5 ]21[. 4Hz עובדה זו מעלה סימן שאלה לגבי התקפות של השימוש בגירויים בתדירות 100Hz ליצירת LTP בחוט השדרה כמודל לרגישות מרכזית בתנאים פיסיולוגים. חשוב לציין כי גירוי בתדירות נמוכה מוביל באופן קלאסי ליצירת long ( LTD 01

,)term depression או במקרים אחרים כמו בתופעת ה wind-up לפוטנציאציה קצרת טווח )כפי שיתואר בהמשך(. אי לכך, השימוש בפרוטוקול גירוי כזה נראה על פניו לא סביר כמודל לרגישות מרכזית המבוסס על יצירת LTP במסלולי כאב. אולם, קבוצת המחקר של ]87[ Sandkühler הראתה )בעזרת סמן )retrograde fluorescent שני אזורים בגזע המוח אשר מידע נוסיספטי מהשכבה הראשונה מגיע אליהם והם ה- parbrachial area וה-.periaqueductal grey area החוקרים רשמו מאזורים אלו את התגובות לגירוי חשמלי בתדירות נמוכה וגבוהה ומצאו כי LTP נוצר ב parbrachial area רק מגירוי בתדירות גבוהה אך לא מנמוכה, ולעומת זאת LTP נוצר ב periaqueductal grey area רק מתדירות גירוי נמוכה אך לא מגבוהה. החוקרים אימתו ממצא זה ע"י יצירת דלקת פריפרית )ע"י הזרקת פורמלין או קפסאיצין בכף רגל של חיה מורדמת(, או גירוי חשמלי בתדירות נמוכה ומדידת LTP ב-.periaqueductal grey area מעניין לציין כי אנטגוניסט לקולטן NMDA מנע LTP למשך 4 שעות, אך גירוי נוסף בתום זמן זה החזיר את ה LTP באופן חלקי. בנוסף, במחקרם של Lars Jùrgen Rygh ועמיתים ]81[, נמצא כי גירוי 'טיבעי' )מעיכת כף הרגל של חיה מורדמת( ייצר LTP בשכבות העמוקות של הקרן הדורסלית בתאי ה WDR למשך 1 שעות לפחות. יש לציין כי החוקרים לא מדדו את תדירות הירי בזמן הנזק ולכן לא ידוע האם מדובר בגירוי בתדירות נמוכה, וכן כי החוקרים לא גירו בתדירות נמוכה כביקורת, אולם עוצמת תגובת התאים הייתה פי 1.5 מתגובת הבסיס שלהם, לעומת פי 0 לאחר גירוי חשמלי בתדירות גבוהה. תוצאה זו ע"פ השערת החוקרים היא ככל הנראה בגלל קלט נמוך יותר ו 0 או בגלל סינכרוניות נמוכה יותר בגירוי הטיבעי לעומת גירוי חשמלי. לסיכום, נראה כי גירוי בתדירות נמוכה עשוי ליצור LTP במסלולי הכאב השונים שנמדדים ע"י כל אחת מקבוצות המחקר. 1.5 תופעת ה :Wind-up תופעת ה wind-up הינה ארטיפקט ניסויי שבו גירוי חוזר של נוסיספטורים בתדירות נמוכה ובעוצמה קבועה, מוביל לתגובות הולכות ומתגברות מהנוירונים שבחוט השדרה. תופעה זו משמשת כלי חשוב במחקר תהליכי עיבוד מידע נוסיספטי בחוט השדרה ומנגנון הריגוש המרכזי. תופעת ה )WU( wind-up נחשבה כשלב מעבר התחלתי או כמקבילה האלקטרופיסיולוגית של רגישות מרכזית ]20, 21[. רעיון זה נתמך ע"י הממצא שקולטני NMDA מעורבים ביצירת שתי התופעות ]21[. אולם, בהמשך, ניטען כי אלו שתי תופעות נפרדות. לדוגמה, נמצא כי ניתן להשרות רגישות מרכזית ללא WU בהפעלת מסלולים ויסצרליים ]0[. הבדל מהותי בין WU לבין רגישות מרכזית הוא משך האפקט הקצר של.WU לדוגמה, ברוב הדיווחים השינויים בגודל השדה הרצפטיבי ועוצמת התגובות לאחר השריית גירוי WU נמשכים למשך דקות בודדות ]72, 25[, 24, בעוד ששינויים הקשורים ברגישות מרכזית נמשכים זמן רב בהרבה )שעות, במידה ולא נגרם נזק למערכת העצבים( ]74[. מחקרים רבים נעזרים במידת ההגברה )WU( כאינדיקציה לריגוש מרכזי ]26[. מספר מחקרים כוונו לבירור הקשר שבין רגישות מרכזית ו- WU בחיות ובבני אדם. במחקרים אלו נמצא כי גירוי חשמלי המייצר WU גרם להגדלה בשדה הרצפטיבי והגברה בתגובה לגירויים על ס פיים stimuli( )suprathreshold ]//27-1[, מתוך כך הגיעו החוקרים למסקנה כי גירויים מחוללי WU יכולים ליצור לפחות חלק מהמאפיינים של רגישות מרכזית. על כן, WU הינו כלי מחקר שימושי עבור אותם אספקטים של התופעה שדומים למאפיינים של רגישות מרכזית. מנגנונים סינפטיים של :wind-up גירוי נוסיספטורים באופן רפטטיבי מביא לשחרור בו זמני של גלוטמט ונוירופפטידים נוספים כמו substance P ו- (CGRP) calcitonin gene-related peptide מקצות הנוסיספטורים בקרן הדורסלית. גלוטמט נקשר לקולטני AMPA והנוירופפטידים שמפעילים קולטנים מצומדי חלבון G מביאים לדה-פולריזציה פוסט- סינפטית הנמשכת כמה מאות אלפיות-שנייה. גירוי רפטטיבי בתדירות יחסית נמוכה )5-1./ )Hz יוצר סכימה של 04

הפוטנציאלים האיטיים הללו עם כל גירוי, כך שמתקבל גירוי חדש עוד לפני שהתגובה הקודמת הספיקה לדעוך, באופן זה התגובות נבנות אחת על השנייה. במהלך הגירויים נוצרת רמת דה-פולריזציה בתא הפוסט-סינפטי שגורמת לשיחרור חסימה תלוית מתח של קולטני NMDA ע"י יון Mg 2+ ובעקבות כך יש גיוס נוסף של תעלות Ca 2+ והגברת התגובות הפוסט- סינפטיות ויצירת דפוס ה ]1, wind-up 74[. מחקרים ראשוניים הראו כי רישום תגובות אלקטרומיוגרפיות )EMG( משריר הירך )הרפלקס הפלקסורי( של חתול, יכולים להוות אינדיקציה לסכימה בזמן ]1/1[ ומאז נבחנה תקפותה של שיטה זו בבני אדם וחיות. במחקרים אלה נמצא טווח תדירות דומה עבור ניסויי WU במדידות רפלקסים ומדידות שנעשו מהנוירונים בקרן הדורסלית ]72[. סוגי הנוירונים המשתתפים בתהליך: בקרן הדורסלית של חוט השדרה קיימות שלוש קבוצות עיקריות והן: )LT( low threshold מקבלים קלט מסיבי Aβ ומגיבים לגירויים חלשים. תאי )NS( nociceptive specific המקבלים קלט מסיבי Aδ ו- C ומגיבים באופן ספציפי לגירויים נוסיספטיים. )Aβ, Aδ and C( תאים המקבלים מידע תחושתי מכל הסיבים,)WDR( wide dynamic range תאי ומגיבים לכל קשת עוצמות הגירויים. נתגלה כי מבין שלוש הקבוצות תאי ה WDR הם המשתתפים העיקריים ביצירה של דפוס ה WU )ובמידה פחותה תורמים גם תאי.]72[)NS בנוסף, תגובות ה WDR מתרחשות בהתאמה גבוהה עם תגובות הרפלקס השריריות )EMG( ]1/0-1/4[. גירוי רפטטיבי של נוירונים מסוג WDR גורם להגברה בתגובתם ולכן הם נחשבים מחוללי דפוס ה ]72[. WU בנוסף נמצא כי פעילותם מבוקרת ע"י אינטר-נוירונים אקסיטטורים )glutamatergic( ואינהיביטורים )GABAergic( בחוט השדרה. בקרה נוספת על פעילות תאי WDR מבוצעת ע"י אזורים גבוהים יותר במוח. עובדה זו נמצאה בניסויים בהם נותק המוח מחוט השדרה וגזע המוח.)decerebration( פעולה זו גורמת לתופעה המכונה,decerebrate rigidity מצב שבו ארבעת הגפיים נוקשות 0 מאובנות כתוצאה מחוסר אינהיביצה, הפעלת יתר של שרירים אקסטנסורים וחוסר בקרה על פלקסורים. ואכן, בניסויים בהם נותק גזע המוח בנקודה זו, נמצאה הגברה משמעותית בעוררות הנוירונים שבקרן הדורסלית והגברה ב WU ]1/5[. לעומת זאת, במידה וחוט השדרה נחתך מתחת למדולה, הנוירונים המוטורים )השדרתיים( מאבדים את כל הקלט מהגרעינים המוטוריים שבגזע המוח. במצב כזה החיה רפויה, ללא יכולת לעמוד או לשמור על כל תנוחה ורק רפלקסים המתווכים בלעדית ע"י נוירונים שדרתיים יתפקדו ]1/6[. גוזריו ועמיתיו )M ]1/7[( Gozariu, חקרו את בקרת ה WU ע"י גירויי סיבי C ומדידת EMG מהרפלקסים בשריר biceps femoris בחיות מורדמות ללא פגיעה בחוט השדרה.)intact( בניסויים אלה נצפתה עקומה דו-פאזית המחולקת לשלב עליה פרוגרסיבי במהלך התגובות הראשונות, מלווה בשלב רוויה ודעיכה בתגובות המאוחרות. אולם לאחר ביצוע,decerebration ואחר כך - או חתך בגזע המוח )ברמת ה,obex הקצה התחתון של החדר הרביעי ממנו מתחילה התעלה המרכזית(, או חתך ברמה תורקלית )8-10 T(, הרפלקסים לגירוי סיבי ה C המשיכו להתגבר מהגירוי הראשון לאורך כל סדרת הגירוי ועקומת התגובות שהתקבלה הייתה מונו-פאזית במגמת עליה ]1/7[. נראה לפיכך כי ההפחתה בתגובות או ההסתגלות )habituation( הנצפית בניסויים בחיות intact הינה תוצאה של פקודות יורדות מהמוח ]1/7[. לחתך בחוט השדרה יכולה להיות גם השפעה הפוכה. ניסויים אלו נערכו בחיות מורדמות שהושרתה בהן דלקת בכף הרגל )ע"י.)carrageenan נמצא כי השריית הדלקת הביאה להגברה משמעותית ב WU )גם מסיבי ה- A וגם מה- C ( לעומת חיות הביקורת. בנוסף נמצא כי חתך בחוט השדרה ברמה תורקלית )8-10 T( גרם להפחתה משמעותית ב.WU חיות הביקורת ללא הדלקת הראו הגברה ב WU )רק מסיבי ה- C ( וגם בהן נמצאה ירידה ב WU לאחר ניתוק חוט השדרה ]1/6[. לפיכך פעילות מוחית )על-שדרתית( היא הכרחית עבור יצירת WU במצב תקין. אולם, במצבים 05

פתולוגיים בהם נוצר תהליך היפראלגסיה קודם לחתך )כדוגמת הדלקת(, תתקיים הגברה ברפלקס אך לעומת חיות ללא חתך שדרתי היא תהיה מופחתת משמעותית. 1.3 מעורבות תאי מיקרוגליה ואסטרוציטים בכאב: פגיעה ברקמה מלווה בתהליך דלקתי שמטרתו להגן מפני פתוגנים, להסיר רקמה פגועה ולתקן את הנזק. הכאב הוא אחד המאפיינים המרכזיים של דלקת, ומטרתו שינוי התנהגותי שימנע את החשיפה לגירוי המכאיב ויסייע בתהליך ההחלמה של האזור הפגוע. תחושות כאב מועברות ומעובדות ע"י מערכת העצבים; בשנים האחרונות מתברר שלתאי גליה, כולל מיקרוגליה ואסטרוציטים, השפעה מהותית על עיבוד זה ]1, 1/2[. 1/8, תאי גליה מקיימים, ככול הנראה, רשת קשרים מורכבת עם נוירונים, ובדרך זו יוצרים פעילות פרו- או אנטי-דלקתית אשר מווסתת את רמת העוררות במסלולי הכאב. באופן אנלוגי לפלסטיות נוירונלית, תאי מערכת החיסון והגליה משנים מצבי מוכנות ופעילות בעקבות הפעלה קודמת, ותורמים בכך להגברת העוררות במסלולי הכאב. מרגע שתאי גליה הופעלו הם עשויים להפריש מתווכי דלקת כמו ציטוקינים פרו- או אנטי- דלקתיים, כימוקינים, ובנוסף פפטידים אופיואידים מדכאי כאב ]/11[. מתווכי דלקת אלו מגבירים את תדירות הירי בנוירונים דבר המתבטא בתחושת כאב מוגברת ]82[. דלקת ורגישות נוסיספטורים פריפרית: תאים של מערכת החיסון, כולל תאי מיקרוגליה,מציגים על פני הממברנה קולטנים מסוג )TLR( Toll-like receptors ]111[. תפקידם של קולטנים אלו הוא להקשר לפתוגנים או למולקולות אנדוגניות של תאים מפורקים )לדוגמה- חלבוני עקת חום: HSP אוprotein )HMGB1 :high mobility group box 1.]110[ לאחר קישור ל TLR מתחיל תהליך בתא החיסוני של שרשרת מעבר אותות להפעלת )NF-κB( nuclear factor-κb הנכנס לגרעין התא ומביא לשיעתוק גנים של ציטוקינים פרו-דלקתיים ]111[. בהמשך התהליך ציטוקינים אלו פועלים ישירות על קולטניהם בקצות העצבים בפריפריה להתחלת פוטנציאלי פעולה ספונטאניים או מוגברים בתגובה לגירויי מגע וחום ]/2, 114[. אינטראקציות בגנגליונים תחושתיים: קצות הסיבים הפריפריים וגופי העצבים שלהם שב DRG מוליכים את הקלט העולה אל הקרן הדורסלית שבחוט השדרה. גופי התאים שב DRG מוקפים בתאי לווין גליאליים קטנים cells( small satellite glial או )SGC אשר יכונו בהמשך תאים סטליטים. בדומה לאסטרוציטים שבמערכת העצבים המרכזית, הסטליטים מחוברים ע"י צמתי מעבר junctions(,)gap תומכים בנוירונים באספקת חומרים מזינים וויסות רמות גבוהות של נוירוטרנסמיטרים ויונים חוץ תאיים ]115, 116[. קבוצה נוספת המאכלסת את ה DRG הם המקרופאגים המספקים הגנה חיסונית באזור זה ]117[. הקרבה שבין התאים הסטליטים לנוירונים מאפשרת תקשורת פאראקרינית הנחשבת מנגנון חשוב ב DRG ליצירת רגישות פריפרית ]115, 116[. עדויות חדשות מראות כיצד אינטראקציות אלו מקדמות את המעבר למצבי כאב כרוניים. נמצא כי בעקבות הזרקת complete ]118, DRG בין התאים הסטליטים ב gap junctions לכף הרגל, חלה עליה ברמת הצימוד ב )CFA( Freund s adjuvant 112[. יתר על כן, הזרקת retrograde tracer למפרק הלסת joint( )temporomandibular מראה הצטברות של הסמן בתאים הסטליטים רק לאחר יצירת דלקת במפרק בעקבות הזרקת קפסאיצין קודמת ]/10[. חשוב לציין כי בהעדר גירוי מכאיב אין צימוד בין נוירונים ב DRG או בין נוירונים ותאים סטליטים. לפיכך, תקשורת מוגברת בין הסטליטים והנוירונים לאחר גירוי פריפרי מזיק מגבירה רגישות פריפרית בנוירונים הראשוניים, ומביאה להתפשטות העוררות לנוירונים ותאים 06

סטליטים סמוכים ]101[. רגישות והתפשטות לתאים סמוכים יכולה להוות מנגנון עבור מצבי כאב בהיקף של אזור הפגיעה הראשוני, למשל מדרמטום אחר. תרומה נוספת לריגוש נוסיספטורים מתרחשת בפעילות דו-כיוונית 0 הדדית בין סטליטים לבין נוירונים בגנגליונים. שחרור CGRP מנוירונים משרה יצירת IL-1β בתאים הסטליטים. נמצא כי IL-1β )אך לא IFN-γ או )TNFα מגביר את ייצור פרוסטגלנדין )PGE2( E2 דרך מסלול COX2 בסטליטים. בהמשך PGE2 מעודד במשוב חיובי לייצור CGRP נוסף בנוירונים שבגנגליון וע"י כך להגברת ריגוש הנוסיספטורים ]100[. הצטברות של כמוקינים וציטוקינים פרו- או אנטי-דלקתיים בגנגליונים לאחר גירוי מזיק עשויה לתרום לריגוש הנוירונים הסנסורים. ידוע כי ביטויים של TNFα ו-,IL-1β בנוסף למערכת המשלים וכימוקינים אחרים, עולה מיד לאחר גירוי מזיק,101[.]104 הקולטנים לציטוקינים אלו מצומדים לתעלות )transient receptor potential( TRP ותעלות נתרן ( + )Na והם מבוטאים על גבי ממברנות הנוירונים שבגנגליונים. קישור של מתווכי דלקת אלו לקולטניהם עשוי לחולל זרמים חשמליים בנוירונים discharges( )ectopic שמהווים מגבר לקלט הראשוני המגיע לחוט השדרה ]105[. תגובת מערכת העצבים המרכזית לנזק פריפרי: קלט אפרנטי מוגבר מהנוסיספטורים מפעיל את הנוירונים שבחוט השדרה אך גם משנה את הפעילות של תאי הגליה שבמערכת העצבים המרכזית. הפעלת נוסיספטורים מביאה לשחרור של נוירוטרנסמיטורים ונוירומודולטורים כמו גם מתווכי דלקת לחוט השדרה ]106, 107[. חומרים אלה, כולל גלוטמט,,IL-6,BDNF,CGRP,substance P,ATP פועלים על הנוירונים הפוסט-סינפטיים וכן על מיקרוגליה ואסטרוציטים ומבקרים את פעולתם ]1, 108[. 105, 1/2, 1/8, גירוי חשמלי של העצב הסכיאטי בחולדה בעוצמה המפעילה נוסיספטורים מעוררת את הפרשת הכימוקין פרקטלקין fractalkine( )CX3CL1, המשפעל בהמשך תאי מיקרוגליה )כפי שנראה ע"י ביטוי )Iba1 בקרן הדורסלית של חוט השדרה ומגביר רגישות לכאב ]102, /11[. מבקרי פעילות גליה: מחקרים פרה-קליניים רבים תומכים בפעילות גליה בהתפתחות תהליכי כאב. החומרים הנפוצים ביותר במחקרים אלה לצורך עיכוב פעילות גליה הם האנטיביוטיקה מינוציקלין, פלואורוציטרט )רעלן מטבולי תאי(,.)xanthine derivative and phosphodiesterase inhibitor( propentofylline הפעילות האנלגטית של חומרים אלו בבני אדם עדיין לא נבחנה ]4[. :Interleukine-1 (IL-1) 1.1 מערכת ה :IL-1 IL-1 הינו ציטוקין פרו-אינפלמטורי המופרש ע"י תאי מערכת החיסון, וכן ע"י תאי גליה ונוירונים במערכת העצבים ]111[. מערכת IL-1 כוללת שני פפטידים אגוניסטים, IL-1α ו-,IL-1β כמו גם אנטגוניסט אנדוגני IL-1 receptor (IL-1ra),antagonist אשר נקשר לרצפטור )I )IL-1 receptor type ובכך חוסם ומונע את פעילות הציטוקין ]111[. מעורבות IL-1 בתהליכי כאב: פעילויות ישירות של IL-1 על נוירונים: מחקרים הראו כיIL-1 מעורב בפעילות נוירונלית בכל רמה, מקצות העצבים בפריפריה, לגנגליונים הדורסליים,)DRG( לנוירונים השדרתיים, ועד לאזורים גבוהים במוח. פעילויות IL-1 בפריפריה, ב DRG ובחוט השדרה: כאשר IL-1β ניתן בפריפריה הוא הפעיל באופן ישיר נוסיספטורים, הביא לייצור פוטנציאלי פעולה ולהגברה ברגישות לכאב ]/2[. על פי מחקר זה יכולתם של הנוסיספטורים לגלות IL-1β מאפשרת למערכת העצבים לזהות אזורי דלקת תוך כדי הגברה של הרגישות לכאב. לפיכך, לחסימה פריפרלית של IL-1 עשויה להיות השפעה אנלגטית בעת דלקת ]/2[. אפקטים דומים נצפו גם בחוט השדרה. הזרקה לחוט השדרה )intrathecal( 07

של IL-1β גורמת לאלודיניה למגע ולחום. ההשפעה של IL-1β על תאי ה WDR בגנגליון של העצב המשולש ganglion( )trigeminal נבדקה ע"י הזרקתו לחדר הלטרלי במח של חולדות. תגובות מוגברות החלו להתקבל כבר אחרי 5 דקות מההזרקה. השפעה זו הגיעה לשיאה כעבור 05 דקות מההזרקה ואז פחתה בהדרגה. תגובות מוגברות אלו נחסמו לחלוטין באמצעות טיפול מקדים עם החסם ]110[. IL-1ra הקולטן IL-1RI ממוקם צמוד לקולטני ה- NMDA בנוירונים ]111, 114[. הפעלת IL-1RI גורמת לזרחון NMDA וחיזוק סינפטי וע"י כך להיפראלגסיה ]111-115[. מבין חומרי הדלקת הרבים המתווכים בין תאי גליה לבין נוירונים ומקושרים להגברת הרגישות לכאב, IL-1β הוא בעל תפקיד מפתח בבקרת פעילות מיקרוגליה, אסטרוציטים ונוירונים ]111, 117[. 116, נמצא כי ATP נקשר לקולטני P2X7 ומביא לשחרור IL-1β ממיקרוגליה בחתכי חוט שדרה ]116[. תהליך זה מתרחש רק אם קדם לו שפעול של קולטני TLR במיקרוגליה עם,LPS עובדה המצביעה כי הוא מתרחש רק במקרה של פציעה ו 0 או זיהום. עלייה סלקטיבית ב IL-1β באסטרוציטים בחוט השדרה, בגנגליון המשולש,)trigeminal( ב-,)RVM( rostral ventromedial medulla במודלים של כאב ממקור סרטני, דלקת ופגיעה עצבית ]107, 118[, 111-115, מעידה כי אסטרוציטים יכולים להוות מקור חלופי לציטוקין זה. באופן הדוק למחקר הנוכחי, נמצא כי הזרקה של הציטוקין )אקסוגני( יכולה להגביר ]112-140[. WU אולם טרם נבדק האם IL-1 אנדוגני משתתף בתהליך ה- WoW. ממצאים ממעבדתי הראו כי IL-1 בעל תפקיד אף ברגישות לכאב בזאלית 0 בסיסית. במחקר זה נמצא כי עכברים בעלי פגם גנטי בפעילות מערכת IL-1 הציגו ברמת בסיס רגישות נמוכה לגירויים נוסיספטיים יחסית לזן הבר )זן הביקורת( ]141, 144[. חסמי ציטוקינים כטיפול אנלגטי: לציטוקין IL-1 קיימים מספר מעכבים סינטטיים. כינרת Amgen( )Kineret, anakinra, הינו תכשיר רקומביננטי ל.)IL-1ra( IL-1 receptor antagonist נמצא כי IL-1ra המוזרק סיסטמית יכול לחצות את מחסום הדם-מוח ולהגיע לנוזל הצרברוספינלי )CSF( בריכוזים טיפוליים בחולדות ובבני אדם ]145, 146[. אפשרות זו פותחת כיוון חדש לטיפול בכאב ממקור מרכזי. תרופה זו מפחיתה את הכאב הנגרם בדלקות פרקים ומצבים דלקתיים נוספים ]147, 148[. תרופה נוספת )rilonacept, Regeneron( Arcalyst נקשר ל IL-1α ו- IL-1β באפיניות גבוהה וע"י כך חוסם את פעילות הציטוקין ומפחית היפראלגסיה ודלקת במודל של דלקת פרקים ]4[. 1.1 מטרות המחקר הנוכחי: במחקר הנוכחי השתמשנו במודל גירוי חדש המבוסס על תופעת ה- wind-up הגורם לרגישות ארוכת טווח. מודל זה מורכב משלוש סדרות חוזרות של גירוי קצר )wind-up( ורווחי זמן ללא גירוי )/1 דקות(. בניסויים מקדמיים בעת כיול השיטה מצאנו כי קיימת הגברה משמעותית בתגובות מסדרה לסדרה וכי הרגישות לגירויים מכאיבים לאחר גירוי מסוג זה נשמרת לאורך זמן. לתופעת ההגברה הבין סדרתית המתרחשת במודל גירוי זה קראנו.)Wind-up of Wind-up( WoW בעקבות כך הגדרנו את אפיון תופעת ההגברה )אשר כונתה מאז )WoW: Wind-up of Wind-up כמטרתה הראשונה של עבודה זו )מטרה מס' 1(. היות שתופעה זו לא דווחה היה צורך באפיון ראשוני שלה. מטרה מס' 1- אפיון תופעת ה- WoW, נבדקה במספר תתי סעיפים: 1- בדיקת השפעת פרמטרים של סדרת הגירוי על יצירת.WoW בחלק זה בחנו מספר עוצמות גירוי, תדירויות גירוי שונות וכן את חשיבות הרווח הבין סדרתי על יצירת ה- WoW. 0- הגדרנו את המבחן הסטטיסטי לקיום או אי קיום WoW ו-.wind-up השימוש ב wind-up הינו נפוץ עבור חקירת מנגנוני כאב. יחד עם זאת קיימות בספרות המחקרית דרכים שונות עבור החישוב והצגת ה- wind-up אשר עשויים להשפיע על פירוש תוצאות ניסוי זהה ]142[. במהלך אפיון תופעת ה- WoW התחדד הצורך ביצירת שיטת חישוב מהימנה שתבחין 08

בניסויים בהם נוצר או שלא נוצר WoW ע"פ קריטריונים קבועים וידועים )הבדל מובהק בעוצמת התגובות של הסדרה הראשונה לעומת הסדרות הבאות(. בזכות מבחן סטטיסטי זה, מודל ה- WoW התקבל באופן הדיר וזכה לתיקוף מהימן. מטרה מס' 0- בחינת מנגנונים העשויים לגרום לתופעת ה- WoW. מטרה מס' 0 נבדקה במספר תתי סעיפים: 1- האם תהליך ההגברה מתרחש במערכת העצבים המרכזית או בפריפריה. 0- מעורבות קולטני NMDA ב.WoW 1- האם הסמן לרגישות מרכזית- perk מעורב בתהליך. 4- האם תאי מיקרוגליה מעורבים ביצירת ה?WoW 5- האם הגברת ה WoW נובעת משחרור אינטרלאוקין- 1 אנדוגני? מטרה מס' 1- האם גירוי wind-up ו- WoW מבוטאים בהתנהגות כאב. מטרה מס' 4- בדיקת ההשפעה של גירויים קודמים על דפוס ה- WoW. תוצאות הניסויים אלו סיפקו הסבר למשמעות הפיסיולוגית של התופעה ותשובה אפשרית לשאלה מדוע תופעה זו לא דווחה קודם לכן. בנוסף, בסיס הנתונים מניסויים אלו היווה תשתית ליצירת מבחן מנבא מבוסס פרוטוקול WoW המבחין בין חיה נאיבית לעומת חיה בעלת ריגוש מרכזי. 02

4.1 חומרים ושיטות: 4.0 חיות: במחקר זה נבדקו עכברים זכרים בני 14-/1 שבועות מכמה זנים. הזן העיקרי במחקר הוא זן הבר C57BL/6 X CBA שהוא זן הביקורת לזן של עכברים טרנסגנים )IL-1raTG) המבטאים ביתר את האנטגוניסט לרצפטור של אינטרלוקין- 1.(Lundkvist et al., 1999) (interleukin-1 receptor antagonist, IL-1ra) זן נוסף שנבדק במחקר זה הינו C57BL/6 129/Sv X המשמש כזן הביקורת )זן הבר( עבור זן מוטנטי אחר המגודל במעבדתנו. זן זה יוצר במקור במעבדות.(Labow et al., 1997) Jackson Laboratory, Bar Harbor העכברים גודלו בבית החיות בקמפוס הר הצופים. עכברים בוגרים שוכנו בקבוצות של 7-2 חיות בכלוב 17*/1*15 ס"מ. אוכל ושתייה ניתנו ללא הגבלה. בחדרי הגידול התקיים מחזור אור-חושך הפוך בן 10 שעות )כיבוי אור בשעה //:7 והדלקה ב //:12(. המדידות נערכו בזמן שעות החשיכה. מחקר זה אושר ע"י הועדה האתית לשימוש בבע"ח של האוניברסיטה העברית ( מס אישור:.)MD-08-11535-3 4.1 פרוטוקול גירוי ורישום :WoW עכברים הורדמו באמצעות הזרקה של יורתן i.p.( )urethane 2.3 g/kg, /1 דקות לפני סדרת הגירוי הראשונה train( 1(. st כאשר הושגה הרדמה מלאה ויציבה )לאחר כ- 4-5 דקות(, העכבר קובע למשטח השולחן ואלקטרודות ה EMG electrodes( )differential recording הוחדרו אל שריר medial gastrocnemius ואלקטרודת הארקה אל עור האגן בצד הגוף הנגדי. אלקטרודות הגירוי electrodes( )stainless steel needle הוחדרו אל העור שסביב העקב באותה רגל אחורית. אזור זה מעוצבב ע"י העצב הטיביאלי ונמצא במדידות מקדימות כשדה הרצפטיבי להפעלת רפלקס המשיכה של שריר.medial gastrocnemius לאחר החדרת האלקטרודות המגרות רשמנו ללא גירויים את קו הבסיס במשך /1 /6 שניות. בהמשך ניתנו סדרות הגירויים באמצעות סטימולטור ( Devices Digidata,1440 Axon CNS, Molecular )Corporation ויחידת בידוד AMPI).(ISO-flex, כל סדרה מורכבת מ /0 גירויים חשמליים בפרמטרים הבאים: עוצמה-.wind-up בעבודה זו מתן סדרה אחת בלבד של גירויים נקרא גירוי( WU ).1Hz תדירות-,2ms רוחב פולס מרובע-,4mA כאשר העבודה מתייחסת לפרוטוקול גירוי של WoW הכוונה היא לפרוטוקול שמורכב משלוש סדרות גירוי WU זהות המופרדות במרווח בין סדרתי של /1 דקות )כפי שיפורט בסעיף /.5 איורים 6 ו 7(. פרוטוקול הגירוי והרישום מוצא לפועל ע"י תוכנות איסוף נתונים ( CNS, Clampex10, pclamp,10 Axon.)Molecular Devices לאחר הגברה amplifier( )Grass instruments 511-P המידע מרישום ה EMG האנלוגי מועבר למערכת ממוחשבת, מומר לאות דיגיטלי Corporation( )Digidata 1440, Axon CNS, Molecular Devices ונשמר עבור ניתוח מאוחר יותר Devices(.)Clampfit 10, pclamp 10, Axon CNS, Molecular 1/

איור 2: תיאור סכימטי של מערך הגירויים והתגובות במסלול קשת הרפלקס הנוסיספטי. בחלק השמאלי: רישום מקורי של הגירוי החשמלי הניתן במחקר זה. האיור האמצעי מתאר את מעבר המידע על הגירוי המכאיב העולה בסיב הסנסורי אל חוט השדרה והתגובה מהקרן הונטרלית על סיב מוטורי שגורם להפעלת השריר שמושך את הגפה. התאים בחוט השדרה מהווים צומת חשובה לבקרה מהמוח. באיור הימני: רישום מקורי של תגובת הרפלקס מהשריר באלקטרומיוגרם.)EMG( התמונה המרכזית נוצרה ע"י.Alexander & Turner studio Inc 4.1.0 ניתוח נתוני תגובות :WoW כל תגובת רפלקס מורכבת משני רכיבים נפרדים ע"פ זמן הופעתם מרגע הגירוי: הראשון נמצא בטווח שבין //1-/1 מילישניות,(ms) רכיב זה מיוחס לתגובה מסיבי Aδ המהירים יחסית. הרכיב השני נמצא בטווח שבין //4-//1 מילישניות והוא מיוחס לפעילות סיבי C האיטיים יחסית )איור 1(. אות ה- EMG הינו בי-פולארי ולכן לצורך חישוב ערכו, הנתונים הדיגיטליים הומרו לערך מוחלט, על פי חלונות הזמן שצוינו עבור כל אחד מהסיבים Aδ( או C(. בהמשך חושב ה-'שטח מתחת לעקומה' )AUC( עבור כל תגובה. שטח זה מייצג את עוצמת תגובת הרפלקס והוא מחושב כמכפלת האמפליטודה )במיליוולט )mv במשך התגובה ע"פ חלון זמן התגובה ms(.)mv * כל תגובת רפלקס מוצגת כנגד מספר הגירוי כדי לקבל הערכה של התפתחות הסדרה בזמן )איור 7(. 11

איור 3: שיטת המדידה. גירויים מכאיבים גורמים לתחושות כאב שנפרדות ע"פ מהירות ההולכה של הנוסיספטורים.התגובה המהירה מקורה בסיבי ה- Aδ ואילו המאוחרת בסיבי ה- C. גירוי בעוצמה חזקה יוצר תגובות רפלקס הנרשמות כ EMG וניתן להבחין בשתי תגובות אלו. בניסויים המתוארים התוצאות הן מכימות של סיבי C בלבד. המדידה היא של השטח )'שחור על גבי לבן'( כלומר מכפלת טווח הזמן הנמדד באפליטודה ms(.)mv * ניסוי רישום מקביל מהשריר )EMG( ומהעצב הסכיאטי )ניסוי 3.1.0(: החיות הורדמו ביורתן i.p.( 2.3(. g/kg, מיד לאחר החדרת אלקטרודות ה EMG כפי שתואר קודם, נחשף העצב הסכיאטי בגישה לטרלית. פרוקסימלית לפיצול הסכיאטי, העצב הופרד מרקמות צמודות לאורך 4-7 מ"מ. שפתי העור הורמו ליצירת בריכה עבור שמן פאראפין. שכבת הפרינאום של העצב הסכיאטי נחתכה באתר הרישום. בעזרת פינצטות שען חדות )מס. 5( ותחת מיקרוסקופ בהגדלה X40 נותקו סיבי אקסונים בודדים מהכיוון הפריפרי של העצב אך נותרו מחוברים לצד מערכת העצבים המרכזית. הסיבים המנותקים הונחו על אלקטרודת רישום כסף-כלורית )Ag/AgCl( עם אלקטרודת רפרנס בשריר קרוב. במידה ונמצא כי הסיב שהונח שייך לשדה הרצפטיבי של הגירוי ע"פ התגובות מהסדרה הראשונה, ניתנו הסדרות הבאות. לא ניתנו גירויים מקדימים לסדרה ה 1. st נתוני תגובות השריר והעצב נורמלו ל.z-scores ההשוואה בין התגובות נעשתה באמצעות קורלציית פירסון correlation(.)pearson's ניסוי חיתוך חוט השדרה )ניסוי 3.1.1(: מהלך הניתוח: שלב זה נעשה תחת הרדמת איזופלוראן )0.5% בחמצן(. ראשית נעשה חתך בעור ובשרירים מעל החוליות ברמת בית החזה )תורקליות T(. 3-4 בהמשך בוצעה פתיחה של החוליות )laminectomy( בעזרת מספריים קפיציות, וחוט השדרה נחתך לחלוטין. בקבוצת ביקורת )sham( ביצענו חתך בעור ובשרירים שמכסים את החוליות התורקליות. בשתי הקבוצות השרירים והעור שמעל אתר החיתוך נתפרו. בהמשך החיות הוחזרו לכלוב למשך כשעה להתעורר מההרדמה ולבדיקת שיתוק בגפיים תחתונות. לאחר שלב זה הן הורדמו ביורתן ונבדקו בפרוטוקול ה- WoW )תהליך הניסוי מוצג באיור /0(. הערה: הגירויים ניתנו /6 דקות אחרי החתך השדרתי כדי להימנע מתופעת ה- spinal shock )חוסר פעילות בדקות הראשונות שלאחר החיתוך ובהמשך פעילות ספונטנית ותגובתיות מוגברת בחוט השדרה] 142 [(. 10

ניסוי גירוי תרמי מקדים ל WoW )ניסוי 3.3.0(: החיות הורדמו ביורתן ולאחר שהושגה הרדמה מלאה הוחדרו אלקטרודות ה EMG והארקה. הגירוי התרמי ניתן באמצעות מקור אור בעל עוצמה שכוון לכף הרגל האחרוית ע"י קרן אור ממוקדת ( Life Tail Flick Test Analgesia meter, IITC.)Science Inc הפעלת החימום נעשתה במקביל עם תחילת רישום ה EMG עבור זיהוי רפלקס משיכת הרגל. הפסקת החימום נעשתה מיד עם זיהוי תגובת EMG על מנת למנוע נזק רקמתי. בכל ניסוי ניתנו שלושה גירויים תרמיים במרווח של 0 דקות בין הגירויים. /1 דקות אחרי הגירוי התרמי האחרון, ניבדק פרוטוקול ה.WoW 4.4 אימונוהיסטוכימיה: סימון perk לאחר גירוי.WU החיות הורדמו ביורתן ע"פ הפרוטוקול הקבוע וחוברו לאלקטרודות הגירוי למתן סדרת wind-up אחת. על מנת לזהות את ההגברה הנראית בסדרה ה 2, nd החיות עברו פרפוזיה בדיוק /1 דקות לאחר הגירוי תחילה עם באפר סליין ( transcardial )perfusion with 250 ml of 0.1M phosphate buffered saline PH 7.4 at 37 C ובהמשך נפח זהה של 1/% תמיסת פורמלין HT-501128-4L( )sigma בטמפרטורת החדר. הסגמנטים הלומברים L4-L6 הוצאו מעמוד השדרה וסומנו בצד הגירוי. חוט השדרה עבר קיבוע נוסף בקירור 4 C ב 0.5% פורמלין למשך לילה. הרקמות המקובעות הועברו לתמיסת סוכרוז %/1 ב PBS 1M./ למשך לילה עבור שמירה על הרקמה בתהליך ההקפאה. הקפאת הרקמות נעשתה בתמיסת )Tissue-Tek, Sakura Finetechnical Co, Tokyo( O.C.T על קרח יבש. הדגימות נשמרו במקפיא 80 C-. בהמשך הדגימות נפרסו בקריוסטט cryostat( )Leica CM1850 באופן סדרתי לפרוסות בעובי /1 מיקרון. הפרוסות הונחו והודבקו על זכוכית נושאת PLUS( )Coated slides-superfrost ונשמרו במקפיא 20 C-. עבור הסימון, סדרות מכל החתכים נשטפו ב 0.4%( Triton100 in 0.1M PBS( PBST עברו חסימה לא ספציפית עם תמיסת חלבונים FCS ו- PBST במשך שלושה ימים solution( 10% fetal calf serum,biological ( )blocking Rabbit נעשתה שטיפה עם נוגדן ראשוני perk כדי לסמן תאים חיוביים ל.)industries Israel Beit Haemek LTD anti mouse-p-erk למשך לילה ב 4 C. לאחר מספר שטיפות ב PBST הרקמות עברו אינקובציה עם נוגדן שניוני RRX-conjugated donkey anti-mouse וכן FITC-conjugated Goat anti-rabbit (Chemicon #AP132F, 1-50) with לאחר ההדגרה עם הנוגדן השניוני הזכוכיות נשטפו עם.(Jackson Immunoresearch,#715-295-150 (1:100 LTD), anti-fade medium (Citiflour, Bel-Gar כוסו בזכוכית מכסה ונשמרו במקפיא. צביעה ל- :DAPI סמן ה DAPI מסמן גרעיני תא. צביעה זו נעשית כביקורת על מנת לשלול קישור לא ספציפי של הנוגדנים )צביעה כפולה( לתווך בין תאי. כל צביעה נצפתה וצולמה תחת הגדלה של X10 ו- X20 במיקרוסקופ אולימפוס BX-51 מצויד במצלמת אולימפוס.DP-70 בכל חתך נספרים רק גרעינים עם סימון כפול של perk וסימון ל DAPI )כפי שמוצג באיור 4(. ספירת הגרעינים המסומנים נעשתה בנפרד ע"י שני נסיינים בלתי מודעים לזהות החתכים, והתוצאה המוצגת היא ממוצע של שתי המדידות. 4.4.0 האם סדרת גירויים של WU יכולה להביא לעליה ב perk תוך 10 דקות מהגירוי? בניסוי זה החיות הוקרבו 10 דקות לאחר מתן סדרה אחת של WU ועברו פיקסציה בפורמלין. בניסויים מקדימים אלו מצאנו כי חיות ביקורת שעברו תהליך דומה, הכולל הרדמה, קיבוע לסט והחדרת אלקטרודות הגירוי והרישום, אך ללא הגירוי החשמלי, לא מראות סימון perk כלל )איור 4(. 11

Average number of perk positive cells איור :4 גירוי WU מביא תוך 10 דקות לעליה בביטוי.pERK באיור זה התמונות הימניות מייצגות את קבוצת הביקורת ואילו השמאליות את קבוצת הניסוי )חיות שקיבלו גירוי.)WU שתי התמונות העליונות מדגימות את הסימון ל perk ואילו התחתונות מדגימות את הסימון ל-.DAPI סימון האליפסה הצהובה מסמן את אזור המדידה בצד האיפסילטרלי לרגל המגורה. ניתן להתרשם מרמת הסימון הגבוהה בלמינות החיצוניות של הקרן הדורסלית בקבוצת הגירוי לעומת קבוצת הביקורת. בנוסף, בקבוצה המגורה )איור 5(, מצאנו עליה משמעותית במספר התאים שהראו סימון ל-,pERK 10 דקות לאחר הגירוי הראשון בצד האיפסילטרלי לעומת הצד הקונטראלטרלי בשכבות השטחיות ]0.0001>p (1,62)F[ ;38.532= פי 0.2 ואילו בשכבות העמוקות פי ]0.004>p 1.8 (1,62)F[. ;9.151= הניסוי נערך בזן הבר )CBA X C57BL/6( WT המשמש ברוב הניסויים במחקר זה. 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 perk in the dorsal horn of WTtg following wind-up train * superficial ipsi contra * deep Anatomical location איור: 5 רמת ביטוי 01 perk דקות אחרי סדרת WU אחת. עמודות בצבע אדום מסמלות צד איפסילטרלי ואילו עמודות בצבע כחול מסמלות צד קונטראלטרלי. בצד שמאל בגרף מוצגות המדידות מהשכבות החיצוניות ובצד הימני מהשכבות העמוקות. סימן כוכבית מייצג הבדל מובהק בין העמודות..N=5 14 4.5 מדידות התנהגותיות:

4.5.0 רגישות למגע test( )von-frey העכברים הונחו על גבי רשת מתכתית, מתחת לקופסת פלסטיק שקופה להסתגלות של 5 דקות, ולאחריה הם נמדדו באמצעות מברשית וון- פריי USA(.)Touch-TestTM kit, North Coast Inc., כל רגל נמדדת בנפרד. דרושות שלוש תגובות מובהקות )הרמת הרגל( בתגובה ללחיצת המברשית לכף הרגל על מנת לקבוע כי העכבר רגיש למברשית בעובי מסוים. המדידה מתחילה עם מברשית המפעילה לחץ של 1.4 גרם, ובהמשך העכברים נמדדים עם מברשיות המפעילות יותר או פחות לחץ בהתאם לתגובותיהם; תגובה למברשית מסויימת תוביל למדידה במברשית המפעילה לחץ קטן יותר, ולהיפך, כך עד למציאת סף התגובה ללחיצה. המדידות נעשו על ידי נסיינים בלתי מודעים )'עיוורים'( לזהות קבוצות וסוגי הגירויים בכל ניסוי. 4.5.1 רגישות לחום test( )Hargreaves כל חיה מונחת על משטח זכוכית בתא פרספקס נפרד )במתקן בעל 8 תאים( למשך מספר דקות להסתגלות. במהלך המדידה הנסיין בודק תחילה את תגובת הרגל הימנית של כל החיות ולאחר מכן את הרגל השמאלית ע"פ סדר התאים; באופן זה, לכל חיה יש מספר דקות ללא גירויים בין מדידה למדידה. המדידה נעשית באמצעות חימום כף הרגל ע"י קרן אור ממוקדת בעוצמה קבועה Inc(.)Analgesia meter test, IITC Life Science ברגע הפעלת האור מתחילה ספירת שניות. המודד מפסיק את פעולת החימום מיד כשמזהה משיכה של הרגל ובאותו רגע נעצרת ספירת השניות. המדד לרגישות לחום הינו זמן התגובה. כדי למנוע נזק לרגל כף הרגל המכשיר מכבה את קרן האור לאחר עשר שניות. 4.3 חומרים: IL- העכברים הוזרקו תוך ציפקית באנטגוניסט,WoW ו- wind-up אנדוגני במהלך כדי ללמוד על פעילות IL-1 :IL-1ra Kineret ( 4 C במזרקים נשמר ב IL-1ra 100 או 200( /1 דקות לפני סדרת הגירויים הראשונה. החומר mg/kg( 1ra )100mg/0.67ml, Biovitrum AB ונמהל בסליין לריכוז ההזרקה באותו רגע. לחיות הביקורת הוזרק סליין בנפח זהה.)MegaPharm LTD( האנטגוניסט נרכש ממגה-פארם ישראל.)10ml/kg( :MK-801 כדי ללמוד על פעילות קולטני NMDA בתהליך ה,WoW השתמשנו באנטגוניסט לא תחרותי בעל אפיניות גבוהה: MK-801 Dizocilpine hydrogen maleate, (5R,10S)-(+)-5-Methyl-10,11-dihydro-5H-(.)dibenzo[a,d]cyclohepten-5,10-imine hydrogen maleate החומר נרכש מ.Sigma-Aldrich החומר הומס בסליין solution( 0.9%( NaCl לקבלת ריכוז אחסון 1mg/ml שפוצל למספר מבחנות במקפיא 80 C. כל מבחנה הופשרה והחומר נמהל והוכן זמן קצר לפני הזרקה. בניסויים מקדימים מצאנו כי לריכוזים:,0.5 0.1mg/kg ו- 0.75 אין השפעה על תהליך ה,WoW אי לכך הניסויים המוצגים נערכו בריכוז.1mg/kg מינוציקלין hydrochloride( )Minocycline נרכשה ב.Sigma-Aldrich החומר הומס בסליין לקבלת ריכוז אחסון.10mg/ml החומר נמהל והוכן זמן קצר לפני הזרקה בריכוז.30mg/kg ההזרקות נעשו 8 04, ו- 1 שעות לפני הסדרה הראשונה. חיות הביקורת הוזרקו באותם זמנים בנפחים זהים של סליין.)10ml/kg( 4.1 ניתוח סטטיסטי: 15

נתוני התגובות של ניסויי ה WoW מוצגים כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated המשתנה התוך-נבדקי הוא מספר הגירויים בסדרה והמשתנה הבין-נבדקי הוא הסדרה. הנתונים מהניסויים ההתנהגותיים נבדקו גם הם בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated כאשר המשתנה התוך-נבדקי הוא זמני הבדיקה השונים והמשתנה הבין-נבדקי הוא הטיפול. הסתברות קטנה מ 5/./ (0.05>P) נחשבה מובהקת. 16

5.1 מודל ה wind-up ומודל ה :WoW איור : 6 תיאור סכמטי ודוגמה לרישום WoW בחיה. משמאל: תיאור סכמטי של מהלך הניסוי הבסיסי. בסכימה זו, 01 דקות לאחר ההרדמה ניתנת סדרת הגירויים הראשונה ( st 1( ובהמשך במרווחים של 01 דקות ניתנות הסדרות השנייה ( nd 2( והשלישית ( rd 3(. מימין: ניתן לראות את התפתחות ה- WoW ברישום EMG במהלך שלוש סדרות trains( 1(. st 3- rd ניתן לראות כי ההגברה לא מבוטאת בתגובות לגירויים הראשונים בכל סדרה, אבל נראית בבירור על פני הסדרה השלמה. בניסויים המתוארים בהמשך המאפיינים של סדרת הגירויים הבסיסית )WU( הם: 20 גירויים בעוצמה,4mA רוחב פולס,2ms ובתדירות 1 הרץ. פרוטוקול ה WoW הבסיסי כולל שלוש סדרות כאלו במרווח בין-סדרתי של /1 דקות )איור 7 סכמה שמאלית(. התוצאה של סדרת גירויים אחת נראית בתמונה העליונה בחלון העליון- 1 st train )איור 6(. כאשר חזרנו על סדרת הגירויים פעם שנייה כעבור 10 דקות, ופעם שלישית אחרי עוד 10 דקות, מצאנו כי התגובות בסדרות השנייה והשלישית חזקות באופן משמעותי )הסדרות הבאות 2 nd ו- 3 rd מופיעות מתחת לעקומה הראשונה; איור 6 ואיור 7 גרף ימני(. התגובה לסדרה הראשונה היא ליניארית ומתונה ובמחקר זה אנו מכנים אותה,)WU( wind-up ואילו התגובות לסדרות השנייה והשלישית הן עקומות רוויה. לתופעה זו קראנו windup of windup או בקצרה.WoW חשוב לציין כי ההגברה לא נראית בשתי התגובות הראשונות שבכל סדרה )איור 6 פאנל שמאלי תחתון( אלא על פני התפתחות הסדרה השלמה או לקראת סופה כפי שניתן לראות באיור 6 פאנל ימני תחתון. עוצמת התגובות לסדרות הגירויים מחושבות כשטח מתחת לעקומה AUC( )area under the curve; שיטת החישוב מפורטת בפרק 'חומרים ושיטות'. תגובות הרפלקס הממוצעות של מספר חיות בניסוי מוצבות בגרף כנגד מספר הגירויים כדי 17

להתרשם מהתפתחותן לאורך סדרת הגירוי )איור 7 גרף ימני(. שלוש הסדרות מוצגות בכל גרף כדי להתרשם מהתפתחות הסדרות לאורך זמן הגירויים. איור : 7 גרף מייצג להתפתחות ההגברה הבין סדרתית-.WoW דוגמה מייצגת לגרף WoW של קבוצת ניסוי. ניתן לראות את התפתחות ה- wind-up מסדרה לסדרה. הסדרה הראשונה )WU( מוצגת בקו ריבועים מלאים שחור, הסדרה השנייה והשלישית )WoW( מוצגות כקו משולשים כחול וירוק בהתאמה. ניתן לראות כי ההגברה לא נצפית בתגובה הראשונה והשנייה של כל סדרה. התגובות מוצגות כממוצע ( mean ±( S.E.M של,(area under the curve) AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. דוגמה לניתוח הסטטיסטי ומשמעותו עבור ניסוי WoW )שבאיור 7(. המבחן הראשון שמוצג בודק האם נמצא אפקט עיקרי לסדרה. ממצא מובהק מלמד על הבדל משמעותי בין הסדרות ה- 2 nd וה- 3 rd בהשוואה לסדרה ה 1. st המשמעות של הבדל זה היא שנוצר WoW )הגברה משמעותית(. תוצאת מבחן זה עבור הניסוי באיור 7: ]0.045>p (2,12)F[ ;5.385= מלמדת כי נוצר.WoW כמו כן נבדק אפקט עיקרי לגירויים. ממצא מובהק מראה על הבדל מובהק בתגובה בתוך הסדרות, משמע שנוצר )contrast test( בניתוח קונטרסט (19,114)F[. ;10.842= ]0.011>p בתוך הסדרה(. תוצאת מבחן זה: )הגברה WU תוך-נבדקי בוחן מי מהסדרות )השנייה או השלישית( שונה באופן מובהק מהראשונה. מבחן הקונטרסט עבור הסדרה השנייה ]0.087>p (1,6)F[ ;4.188= והשלישית ]0.018>p (1,6)F[ ;10.309= כלומר הבדל מובהק בין הסדרה השלישית לראשונה וקרוב למובהק בין הסדרה השנייה לראשונה. 18

3.1 תוצאות: 3.0 בדיקת פרמטרים 3.0.0 השפעת תדירות הגירוי על יצירת ה- :WoW בבדיקות פרמטרים של תדירות נמצא בעבר כי הטווח לייצר את תופעת ה- WU נע בין 0.5Hz ל- ]72[. 5Hz במחקר הנוכחי בדקנו יצירת WoW בתדירויות הבאות: 1, 0.1, ו-.2Hz לא ניתן גירוי בתדירות גבוהה מ 2Hz משום שהרווח בין הגירויים קטן מחלון המדידה של תגובת סיבי ה,)100ms-400ms( C ולכן לא מאפשר לכל התגובה להתרחש ומכאן מקשה על ההשוואה בין הניסויים. לדוגמה ב 3Hz הזמן בין גירוי לגירוי הוא 300ms ולכן חלון המדידה לתגובת ה C מוגבל לזמן מ-.300ms עד 100ms בניסוי זה ניתנו תחילה שלוש סדרות גירויים בתדירות נמוכה של,0.1Hz בטווח שלא מייצר WU אך בעוצמה המפעילה סיבי C. לאחר מכן ניתנה סדרה רביעית בתדירות גבוהה יותר של 1Hz כפי שמוצג באיור הסכמטי הבא )איור 8(. איור : 8 סכמה של מהלך ניסוי השפעת התדירות. בניסוי זה החיות גורו בפרוטוקול ה WoW בתדירות 0.1Hz )חצים שחורים( ולאחר 01 דקות נוספות ניתנה עוד סדרה בתדירות הרגילה 1Hz )מסומן בחץ סגול(. בניתוח כלל הניסוי )ארבעת הסדרות( לא מצאנו אפקט עיקרי לסדרה ]0.07>p (3,18)F[, ;4.707= קרי לא נוצר.WoW יתרה מכך לא נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.07>p (19,114)F[ ;4.209= כלומר לא נוצר WU )איור 9A(. בניתוח קונטרסט test( )contrast תוך-נבדקי בדקנו האם הסדרות השנייה, השלישית והרביעית שונות מהראשונה. מבחן הקונטרסט עבור הסדרה השנייה ]0.177>p (1,6)F[ ;2.340= והשלישית ]0.775>p (1,6)F[ ;0.89= מראה כי הן לא נבדלות מהסדרה הראשונה. אולם, כאשר ניתנה סדרת גירויים רביעית בתדירות 1Hz התגובה שהתקבלה הראתה עלייה מהירה בעוצמת הרפלקס וצורת עקומת WoW מוגברת בהשוואה לסדרה הראשונה ]0.06>p (1,6)F[ ;4.934= )איור 9B(. הנתון האחרון קרוב למובהקות והוא מראה לפחות מגמה כי הגירויים הקודמים בתדירות נמוכה יצרו רגישות מרכזית המבוטאת בסדרה רביעית מוגברת. 12

AUC (mv X ms) AUC (mv X ms) AUC (mv X ms) AUC (mv X ms) A 4th train at 1Hz exhibits augmented wind-up B 0.1Hz stimulation does not produce wind-up A 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 1st 2nd 3rd 4th at 1Hz 5 4 3 2 1st 2nd 3rd 2.5 1 0.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus number n = 7 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus number n = 7 איור : 9 גירוי בתדירות נמוכה לא יוצר wind-up אך גורם לרגישות מרכזית. בגרף מימין (A) ניתן לראות את התגובות לשלוש סדרות גירוי בתדירות נמוכה.(0.1Hz) בגרף משמאל (B) ניתן לראות כי התגובה לסדרת גירוי רביעית )בתדירות של )1Hz מוגברת משמעותית. התגובות מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated התוצאה מלמדת כי קלט נוסיספטי הניתן אפילו בתדירות איטית שלא יוצרת,WU עשוי לחולל היפר-אקסיטביליות במסלולים נוסיספטים הנשמרת בנוירונים באופן סמוי ומתגלה רק בעקבות סדרת גירוי נוספת בתדירות בטווח היוצר.(1Hz) WU 10 8 6 1st 2nd 3rd WoW pattern at 2Hz * B 6 5 4 3 WoW pattern at 1Hz 1st 2nd 3rd * * # A 4 2 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num n=7 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num n=10 איור : 10 השפעת תדירות הגירוי על דפוס ה-.WoW A- דפוס ה WoW בתדירות B-.1Hz דפוס ה WoW בתדירות.2Hz התגובות מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. 4/

בעת גירוי בתדירות 1Hz )איור 10 גרף שמאלי( נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.007>p (2,18)F[ ;6.574= משמע שנוצר ;WoW כמו כן נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.0001>p (19,171)F[ ;37.958= כלומר הבדל מובהק בתגובה בתוך הסדרות, משמע שנוצר.WU בנוסף נמצאה אינטראקציה בין גירויים לסדרה ]0.0001>p (38,342)F[. ;5.922= בניתוח קונטרסט test( )contrast הסדרה השנייה p<0.014[ ]F(1,9) =9.184; והשלישית p<0.012[ ]F(1,9) =9.731; נמצאו שונות באופן מובהק מהראשונה. בעת גירוי בתדירות 2Hz )איור 10 גרף ימני( לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.068>p (2,18)F[ ;6.574= אולם נראית מגמה. נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.020>p (19,114)F[ ;8.931= משמע שנוצר.WU לא נמצאה אינטראקציה בין גירויים לסדרה. בניתוח קונטרסט test( )contrast הסדרה השנייה נמצאה שונה באופן מובהק מהראשונה ]0.019>p (1,6)F[ ;10.216= ואילו השלישית ]0.065>p (1,6)F[ ;5.101= קרובה לשונה אם כי לא מובהקת. 3.0.1 השפעת עוצמת הגירוי על יצירת ה- :WoW הבדיקה נעשתה עבור העוצמות הבאות: 4mA,2mA,1mA,0.1mA ו-.10mA בניסויים מקדימים בהם הרישום נעשה מסיבי אקסונים שנותקו מהעצב הסכיאטי, מצאנו כי גירוי בעוצמה 0.1mA )ברוחב פולס )2ms אינו יוצר פוטנציאל פעולה בסיבי C. בניסוי זה בדקנו את השפעת שלוש סדרות גירוי בעוצמה 0.1mA על מהלך ה-,WoW ובהמשך )/1 דקות אחרי הסדרה השלישית( את התגובה לסדרה רביעית בעוצמה 4mA המפעילה סיבי C )כפי שניתן לראות באיור סכמטי מס' 11(. איור : 11 סכמה של מהלך ניסוי השפעת עוצמת הגירוי. בניסוי זה ניתנו לחיות 3 סדרות גירוי בהתאם לפרוטוקול ה WoW בעוצמה נמוכה 0.1mA( חצים שחורים( ולאחר 01 דקות נוספות ניתנה עוד סדרה בעוצמה המפעילה סיבי 4mA C, )מסומן בחץ סגול(. בבדיקה זו, במתן שלוש סדרות גירויים בעוצמה נמוכה, לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.07>p (3,9)F[ ;6.733= ולא נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.073>p (19,57)F[. ;5.836= בניתוח קונטרסט test( )contrast הסדרה השנייה ]0.244>p (1,9)F[ ;2.086= והשלישית ]0.209>p (1,9)F[ ;2.537= נמצאו דומות לראשונה. כמו כן, סדרת הגירויים הרביעית ]0.094>p (1,9)F[ ;5.838= שניתנה בעוצמה מעל הסף של סיבי )4mA( C לא שונה מהסדרה הראשונה )איור 10(. ניסוי זה מלמד כי גירויים תת-סיפיים לסיבי C לא גורמים לרגישות מוגברת גם אם ניתנים בתדירות היוצרת תגובת C. באופן הפוך ניתן לומר כי על מנת ליצור רגישות מוגברת על הגירויים להיות בעוצמה מעל לסף הפעלת סיבי.WU 41

Area (mv X ms) Area (mv X ms) Low intensity stimulation (0.1mA) does not induce wind-up nor central sensitization 5 4 3 2 1 1st 2nd 3rd 4mA 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num n=4 איור : 12 גירוי בעוצמה נמוכה )0.1mA( לא יוצר WU ולא.WoW התגובות מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated בדיקות נוספות שנעשו בעוצמה 2mA, 1mA ו- 4mA הראו את דפוס ה.WoW עוצמות גירויים בטווח שבין 0.1mA ל-.1mA הינו WU מוצג(; לפיכך, קבענו כי בתנאים אלו הסף הממוצע לייצור )לא WU לא הראו עקביות בתגובות ה 1mA בהמשך בדקנו האם גירויים בעוצמה גבוהה בהרבה מהסף threshold( 10X( יביאו לתגובות מקסימאליות 0 רוויה כבר בסדרת הגירויים הראשונה? בבדיקה זו )איור 11( לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.21>p (2,12)F[, ;1.929= אולם נמצא אפקט עיקרי לגירויים )contrast test( כמו כן לא נמצאה אינטראקציה בין גירויים לסדרה. בניתוח קונטרסט (19,114)F[. ;15.213= ]0.005>p לא נמצאה שונות מובהקת מהסדרה ראשונה לכל אחת מהסדרות הבאות. 15 10 5 Supra-threshold intensity (10mA) stimulation shows WoW pattern 25 1st 2nd 20 3rd 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num n=7 איור : 13 גירוי בעוצמה גבוהה בהרבה מהסף )X10T( יוצר את דפוס ה- WoW. התגובות מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated 40

AUC (mv X ms) AUC (mv X ms) לסיכום, אמנם מהתוצאה הגרפית ניתן להתרשם כי דפוס עקומות ה WoW נשמר )עקומה ראשונה לינארית והבאות עקומות רוויה(. אולם, עוצמת הגירוי הגבוהה הביאה לעוצמת תגובות גבוהה יחסית כבר בסדרה הראשונה ולכן אין הבדל מובהק בין ממוצעי התגובות בסדרות.)WoW( בסיכום סדרות הניסויים לבחינת השפעת הפרמטרים על יצירת,WoW ניתן להעריך כי טווח התדירות לייצור WoW דומה לזה שנמצא בתופעת ה WU )בין 0.5Hz ל-,)5Hz וטווח עוצמת הגירוי נע בין 1mA ל- 4mA )הטווח שבין 4mA לבין 10mA לא ניבדק(, וכי בעוצמה של 10mA לא ניתן לקבל WoW מובהק. 3.0.1 האם תהליך ההגברה מתפתח במרווח שבין הסדרות או כתלות במספר הגירויים? התופעה המוצגת במחקר זה מתארת הגברה בתגובה בין סדרות בנות /0 גירויים כ"א הניתנות במרווחים של /1 דקות. היות ששיא התגובה מתקבל בדרך כלל בסדרה השנייה והינו דומה בסדרה השלישית, ניתן להניח כי נדרשים כ /4 עד /6 גירויים על מנת להגיע לשיא זה, ללא צורך בהפרדה והמתנה בין הסדרות. 10 WoW pattern after 1st train grouped 8 6 1st 2nd * # 3rd B 10 8 6 Wow is a time-dependent process 1st 2nd 3rd A 4 4 2 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num N=7 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Stimulus num N=7 איור 01: תהליך ההגברה תלוי בזמן בין הגירויים ולא במספר הגירויים. A: נתוני המקור, סדרה ראשונה בת 31 גירויים והסדרות הבאות בנות 21 גירויים. B: נתוני הסדרה הראשונה מקובצים לכדי 21 תגובות לצורך השוואת העקומות )בגרף שמאל כל נקודה בסדרה הראשונה מייצגת ממוצע של 3 תגובות עוקבות(. התגובות מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. על כן, בדקנו האם סדרה ראשונה בת /6 גירויים תגיע לרמת התגובות המתקבלת לאחר סידרה של /0 גירויים והמתנה בת ה /1 דקות. בניסוי זה, לאחר הסדרה הראשונה )/6 גירויים( ניתנו סדרה שנייה ושלישית )/0 גירויים בכל אחת מהן( במרווחים של /1 דקות. לשם השוואת הסדרות, הסדרה הראשונה קובצה; כל 1 תגובות עוקבות בסדרה הראשונה מוצעו לקבלת /0 תגובות )כל נקודה בסדרה הראשונה בגרף השמאלי מייצגת ממוצע של 1 תגובות עוקבות( כפי שמוצג באיור 14. בהמשך בוצע הניתוח הסטטיסטי הרגיל. נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.033>p (2,12)F[ ;4.614= וכן נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.001>p (19,114)F[. ;22.192= כמו כן נמצאה אינטראקציה בין גירויים לסדרה [ ;3.838= (38,228)F 0.001>p[. בניתוח קונטרסט test( )contrast נמצאה שונות מובהקת מהסדרה ראשונה לסדרה השנייה אך לא מהשלישית )0.034>p ו- 0.079>p, בהתאמה(. ממצא זה מראה כי ההגברה הנוצרת בהמשך לסדרה הראשונה אינה נובעת מכמות הגירויים הנוספת אלא תלויה בזמן שבין הסדרות. על פי תוצאה זו ניתן להסיק כי המרווח הבין סדרתי חיוני עבור תהליכים המובילים להתפתחות ה- WoW )איור 14 גרף שמאלי(. 41

3.1 תהליך פריפרי או מרכזי? 3.1.0 האם תופעת ה WoW שנרשמה בעבודה זו מקורה בשינויים שחלים בשריר או מקורה בשינויים בתגובה עצבית מרכזית? ידוע כי תופעת ה- WU הינה תופעה מרכזית ]0, /15[. ביקשנו לדעת האם תופעת ה WoW מתרחשת ברמת השריר, דהיינו פריפרית ברמת הטרמינלים עצב-שריר, או בדומה ל- WU היא מייצגת פעילות עצבית מרכזית. כדי לענות על שאלה זו רשמנו בו זמנית תגובות לגירוי חשמלי מהעצב ומן השריר. בהמשך בדקנו האם קיימת התאמה בין התגובות. בצענו סדרת גירויי WoW בעור כף הרגל באזור הגירוי הקבוע, כאשר רישום הפוטנציאלים נערך בו זמנית מהעצב ומשריר gastrocnemius ב-.EMG הרישום מסיבי העצב נעשה לאחר הפרדת מספר סיבי אקסונים bundle) (nerve מהעצב הסכיאטי השלם )הסיבים מנותקים מכיוון הפריפריה אך נשארים מחוברים למרכז כפי שמתואר באיור 15(. בדרך כלל בשיטת רישום זו, סיבי עצב בודדים מונחים על האלקטרודה הרושמת ואז ניתנים גירויים נוסיספטיים בכף הרגל )מקדימים לניסוי( על מנת לוודא כי הסיבים שייכים לשדה הרצפטיבי המגורה. אולם, בדיקת שדה רצפטיבי בעזרת גירויים נוסיספטים עשויה לגרום לסדרה הראשונה להיות כבר מוגברת. כדי להימנע מכך לא ניתנו גירויים מקדימים לפרוטוקול גירוי ה-.WoW לכן, עבור ניסוי זה נלקחו רק חיות שנמצא בדיעבד )בסוף הניסוי( כי הסיבים שנבחרו שייכים לשדה הרצפטיבי המגורה. ניסויים שלא עמדו בקריטריון זה לא נכנסו לשלב האנליזה )מדידת תגובות הסדרה(. איור : 15 איור סכמטי המתאר את אופן ניתוק הסיבים מהפריפריה ושמירתם מחוברים למרכז. בחלקו העליון של האיור נראה ציור של העצב הסכיאטי המתאר את התפצלות העצב הסכיאטי לסעיף תחושתי ולסעיף המעצבב את שריר ה-.gastrocnemius מהענף המוטורי בלבד, ניתקנו סיבים בודדים והנחנו אותם על אלקטרודת הרישום )מסומן בחץ(. בחלקו התחתון של האיור מוצגת הגדלה של אופן ניתוק הסיבים ע"י פינצטות שען והנחתם על אלקטרודת הרישום. בהגדלה זו, בשלב A- צרור העצב נצבט בקצה הפנצטה, שלב B- סיב עצב בודד מנותק מכיוון שמאל )פריפריה( אך מחובר בצידו הימני )מרכז(, שלב C- הסיב מונח על אלקטרודת הרישום. יש לשים לב כי הניתוק הוא מכיוון הפריפריה אך הסיבים נשארו מחוברים לצד מערכת העצבים המרכזית )כיתוב משני צידי התמונה(. מקור הציור התחתון הינו פרופ' מרשל דבור. 44

Area (mv X ms) Area (mv X ms) z-score Nerve בהמשך, הנתונים מתגובות ה EMG והרישום העצבי נורמלו והומרו ל.z-scores חישוב של קורלציית פירסון נעשה )בין תגובות שריר לעצב( לאורך כל הסדרות על כל הניסויים ברצף. בבדיקה זו נמצא מתאם גבוה )0.77 = r( בפעילות שריר- עצב )איור 16(. התאמה גבוהה בפעילות הנמדדת בשני אזורים אלו מעידה כי הפעילות הנמדדת מהשריר במחקר זה הינה ביטוי של פעילות עצבית שמקורה במערכת העצבים המרכזית. Pearson's correlation for simultaneuos recordings B A -3-2 3 2 1-1 0 0-1 -2-3 1 2 3 z-score EMG איור : 16 התאמה גבוהה בין פעילות שריר-עצב. באיור A: דוגמה מייצגת להתאמה הגבוהה ברישום מקביל מהשריר ומהעצב של תגובות לסדרת גירויים אחת. באיור B: מוצג גרף קורלציית פירסון עבור כל הסדרות בכל הניסויים (0.0001>P 0.77=r)., יש לציין כי דפוס ההגברה הנצפה ב WoW לא התקבל למרות ההקפדה שלא לגרות לפני הסדרה הראשונה )איור 17(. 4 Neuroal activity of sciatic nerve 8 1st 2nd 6 3rd B EMG recordings from gastrocnemius muscle 10 1st 2nd 8 3rd 6 4 A 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num 2 n = 7 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num איור : 17 תגובות השריר והעצב בפרוטוקול ה.WoW ניתן לראות כי דפוס התגובות בשלוש הסדרות זהה בעצב )איור B( ובשריר )איור A(. התגובות מוצגות כממוצע ( ± mean )S.E.M של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated לא מצאנו אפקט עיקרי לסדרה גם בעצב וגם בשריר )0.588>p 0.758>p, בהתאמה( אולם נמצא אפקט עיקרי לגירויים )0.003>p 0.005>p, בהתאמה(. כמו כן לא נמצאה אינטראקציה בין גירויים לסדרה )0.187>p 0.415>p, בהתאמה(. בניתוחי קונטרסט test( )contrast לא נמצא הבדל מובהק בין הסדרה הראשונה לסדרות השנייה והשלישית גם בעצב וגם בשריר )0.600>p ו- 0.543>p בהתאמה בעצב ו- 0.635>p ו- 0.721>p בהתאמה בשריר(. מתוצאה זו ניתן לראות כי 45

התגובות הנמדדות מהעצב הסכיאטי )איור 17 גרף ימין( זהות בשלוש הסדרות )ללא הגברה בין סדרתית-.)WoW מממצא זה ניתן היה לשער כי סדרות הגירויים יוצרות תגובות WU קבועות 0 זהות בחוט השדרה כפי שנרשמו בנוירונים המוטוריים, ולכן כביכול ההגברה מסוג WoW מתרחשת ישירות בשריר. אולם, ניתן לראות גם כי תגובות השריר זהות בעוצמתן כלומר, לא נרשם WoW גם באלקטרודת ה EMG )איור 17 גרף שמאל(. הסיבה לכך שלא נראה תהליך הגברה היא מכיוון שסדרת התגובות הראשונה בשריר הינה מוגברת. על כן אנו משערים כי בתהליך הניסוי של הרישום הסימולטני נוצר ריגוש מרכזי כתוצאה מהמניפולציה בעצב ובשריר עוד בטרם ניתן גירוי ה WU הראשון כפי שגם נמצא בניסוי המתואר להלן 6.0.0. 3.1.1 חיתוך עור ושרירי הירך מוביל לרמת גירוי דומה לסדרת WU ראשונה. בעקבות התצפית הקודמת בה לא מצאנו את תופעת ה WoW בעת רישום מקביל מהשריר ומהעצב הסכיאטי, הועלתה השערה כי חיתוך העור ושרירי הירך )לצורך גישה לעצב הסכיאטי( גורם לגירוי נוסיספטי מקדים אשר מביא את תגובות הסדרה הראשונה לרמה גבוהה ולתאוצה אקספוננציאלית. על מנת לבדוק השערה זו בצענו ניסוי בו 10 דקות לפני סדרת הגירויים הראשונה בוצע חיתוך בעור ושרירי הירך באופן המדמה את הניתוח המבוצע בניסוי הרישום במקביל )6.0.1(. כביקורת רשמנו תגובות בקבוצה מקבילה אשר עברה את אותו תהליך ללא שלב החתך. בניסוי זה, לאחר ההרדמה החדרנו את אלקטרודות ה EMG לשריר הגסטרוקנמיאוס ורשמנו את פעילות השריר בעת החיתוך ובהמשך במהלך שלוש הסדרות כמתואר באיור 18. איור : 18 סכמת מהלך ניסוי החתך בעור ושרירי הירך. 01 דקות לאחר ההרדמה התבצע חיתוך העור ושרירי הירך באופן דומה לתהליך הנעשה על מנת לחשוף את העצב הסכיאטי לרישומים/גירויים )מסומן בחץ אדום(. 01 דקות לאחר החתך ניתן פרוטוקול ה.WoW 46

איור : 19 השפעת חיתוך מקדים של עור ושריר ירך על.WoW גרף B- חיתוך מקדים גורם לתגובה מוגברת כבר בסדרת הגירוי הראשונה )כלומר WU מוגבר( לעומת קבוצת הביקורת- גרף A. בפאנל C: ניתן לראות דוגמא מייצגת לתגובת הרפלקס החזקה בזמן חיתוך העור והשריר. התגובות בגרף מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. כפי שניתן לראות באיור 12 בפאנל התחתון מוצג רישום מקורי של תגובות הרפלקס כפי שנרשמו בזמן החיתוך של העור ושרירי הירך. התגובות מעידות על גירוי חזק )מבחינת אמפליטודת התגובה( וממושך. באיור 12 גרף B, ניתן לראות כי לאחר שלב החיתוך, התגובות בסדרה הראשונה מוגברות ובעלות דפוס תאוצה אקספוננציאלי. בקבוצת הביקורת גרף A, נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.009>p (2,10)F[ ;7.796= וכן נמצא אפקט עיקרי לגירויים כלומר שנוצר (19,95)F [ WU 0.001>p ;7.368=[. בניתוח קונטרסט test( )contrast נמצאה שונות מובהקת מהסדרה ראשונה לסדרה השנייה ומהשלישית )]0.035>p (1,5)F[ ;8.293= ו- ]0.034>p (1,5)F[, ;8.443= בהתאמה(. בקבוצת החתך, לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.421>p (2,10)F[..0= ;944 אולם נמצא אפקט עיקרי לגירויים כלומר שנוצר (19,95)F [ WU 0.0001>p ;22.859=[. בניתוח קונטרסט test( )contrast לא נמצאה שונות מהסדרה ראשונה לסדרה השנייה ומהשלישית p<0.307[( ]F(1,5) =1.292; ו- p<0.375[,]f(1,5) =0.949; בהתאמה(. 47

בהשוואה בין קבוצת החיתוך לבין קבוצת הביקורת לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה מעבר לטיפולים [ ;0.86= (2,20)F 0.918>p[ אולם נמצאה אינטראקציה בין סדרה לטיפולים ]0.032>p (2,20)F[ ;4.113= משמע שהקבוצות שונות מבחינת התפתחות הסדרות. בניתוח קונטרסט test( )contrast נמצאה אינטראקציה בין הסדרות לטיפולים, בין הסדרה הראשונה לסדרה השנייה אך לא השלישית )0.047>p ו- 0.06>p בהתאמה(. אולם, לא נמצא הבדל משמעותי באפקט העיקרי בין הטיפולים מעבר לגירוי והסדרה ]0.679>p (1,10)F[. ;0.182= ממצאים אלו מספקים הסבר לתוצאה שהתקבלה בניסוי הרישום במקביל )6.0.1(. ללא גירוי החתך דפוס ה WoW נשמר כפי שניתן לראות בקבוצת הביקורת )חלק שמאלי פאנל עליון(. אולם, לאחר /1 דקות מחתך ברגל סדרת הגירוי הראשונה כבר מוגברת )אין הבדל בין הסדרות(. הבדיקה הסטטיסטית שביצענו אינה מבחינה בין הקבוצות משום שהשוואת הממוצעים בין שתי הקבוצות יחסית קרובה. לצורך השוואה והפרדה בין קבוצות של חיות נאיביות )ללא גירוי נוסיספטי קודם( וחיות מגורות יתואר בהמשך העבודה אלגוריתם יעודי שפיתחנו למטרה זו. 3.1.1 חיתוך חוט שדרה ברמת בית החזה מביא לירידה בתגובות הרפלקס. ידוע כי תגובות הרפלקס הנוסיספטיות מתרחשות ברמה השדרתית וכי קיימת בקרה של המוח על תגובות אלו, אולם בקרה זו טרם אופיינה במודל של.WoW בניסוי זה, תחת הרדמת איזופלוראן, נעשה חתך בעור ובשרירים מעל החוליות ברמת בית החזה )תורקליות T(. 3-4 בהמשך בוצעה פתיחה של החוליות בעזרת מספריים קפיציות וחוט השדרה נחתך. בקבוצת ביקורת )sham( ביצענו חתך בעור ובשרירים שמכסים את החוליות התורקליות. בהמשך החיות הוחזרו לכלוב למשך כשעה להתעורר מההרדמה ולבדיקת שיתוק בגפיים תחתונות. לאחר שלב זה הן הורדמו ביורתן ונבדקו בפרוטוקול ה- WoW )תהליך הניסוי מוצג באיור /0(. הגירויים ניתנו /6 דקות אחרי החתך השדרתי כדי להימנע מתופעת ה- spinal shock )פעילות ספונטנית ותגובתיות מוגברת בחוט השדרה בזמן המידי לאחר חיתוך חוט שדרה(. 2 nd ו- 3 rd איור : 20 סכמת מהלך ניסוי הפרדת חוט השדרה מהמוח. בקבוצת הביקורת )sham( נצפה דפוס ה WoW המקובל )איור 01 גרף שמאלי(. בקבוצת הניסוי, סדרת הגירויים הראשונה יצרה תגובות רפלקס בטווח העוצמות המתאים לסדרה הראשונה )איור 01 גרף אמצעי(. אולם תגובות EMG הבסיס )תגובה ראשונה בכל סדרה( בסדרה השנייה והשלישית היו חלשות בהשוואה לתגובה בסדרה הראשונה. המשך תגובות הסדרות ה- נשארו ברמת הבסיס כלומר, לא נוצר wind-up אלא wind-down יחסית לסדרה הראשונה. 48

AUC (ms X mv) AUC (ms X mv) 5 4 WoW following spinalization opetation 1st 2nd 3rd B 5 4 1st 2nd 3rd WoW following Sham opetation * * # A 3 3 2 2 1 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num n=7 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num n=3 איור : 21 חיתוך חוט שדרה ברמת בית החזה מביא להפחתה משמעותית בתגובות WU ו.WoW גרף A: קבוצת הביקורת,)sham( גרף B: קבוצת הניסוי cut(.)spinal התגובות בגרף מוצגות כממוצע ( ± mean )S.E.M של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. בהשוואה בין קבוצת החיתוך בחוט השדרה לבין קבוצת הביקורת לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה מעבר לקבוצות ]0.204>p (2,18)F[ ;1.874= כלומר שלא נוצר WoW בשתי הקבוצות. בנוסף האינטראקציה שנמצאה בין סדרה לקבוצות ]0.013>p (2,18)F[ ;9.349= מלמדת שהקבוצות שונות מבחינת התפתחות הסדרות בהן. בשתי הקבוצות נוצר WU כפי שנמצא באפקט העיקרי לגירויים מעבר לקבוצות ]0.003>p (19,171)F[. ;12.566= נוסף על כך, האינטראקציה המשולשת בין גירויים סדרה וקבוצות ]0.030>p (38,114)F[ ;4.456= מצביעה על הבדל בהתפתחות הגירויים בסדרות בין שתי הקבוצות. משום שבקבוצת החיתוך תגובות הרפלקס הינן נמוכות באופן כללי, ניתן היה להניח כי החיות איבדו כל טונוס שרירים והיו משותקות לגמרי בעקבות הפגיעה בחוט השדרה. אולם, בחינת ה EMG בניסויים השונים מראה פעילות מופחתת אך לא שיתוק )איור 00 ניתן לראות תגובות EMG בארבעת הניסויים(. 42

איור : 22 רישומים מקוריים של סדרות גירוי לאחר ניתוק המוח. הדוגמא היא מחיה שעברה ניתוק חוט השדרה מהמוח. דוגמא זו מדגימה הפחתה הדרגתית בתגובות הרפלקס מסדרת הגירוי הראשונה לסדרת השלישית. בחלק מן החיות )לא מוצג( נתנה סדרה רביעית לאחר פגיעה בחוט השדרה הלומברי ובכולן כצפוי לא נוצרו תגובות רפלקס. בחלק מן החיות ניתנה סדרת גירויים רביעית לאחר פגיעה בחוט השדרה הלומברי ובכל הניסויים הללו לא נוצרה תגובת רפלקס )לא מוצג(. בנוסף, האפקט העיקרי בגירויים מעבר לקבוצות השונות מלמד כי נוצר WU בשתי הקבוצות, כפי שניתן להתרשם בצורה הגרפית באיור 01 גרף ימני. בהתאמה עם הידוע בספרות ]72, 1/6[, 1/4, העובדה כי נוצר WU לאחר הפרדת המוח מחוט השדרה )אך לא אחרי פגיעה בחוט השדרה הלומברי( מראה כי תופעת ה WU הינה פעילותם של הנוירונים באזור הלומברי בחוט השדרה. אולם התופעה שבה בפרפרט עם חתך שדרתי, סדרת גירויים ראשונה מביאה להפחתה בתגובות לסדרות הבאות במקום הגברה מעידה שיש צורך באזורים מוחיים )על-שדרתיים( עבור יצירת ה.WoW 5/

3.1.4 התאמה בין רמת התאים המבטאים perk ליכולת לייצר.WoW perk (Phosphorylated extracellular signalrelated kinase) עדות נוספת לכך שגירוי ה WU מביא לריגוש מרכזי נמצאה ע"י סימון בחוט השדרה. perk הינה קינזה העוברת זירחון בתאי הקרן הדורסלית בעת הפעלת נוסיספטורים ]14, 58[ 57, ונחשבת לסמן מוליקולרי עבור ריגוש מרכזי. בדיקות זני עכברים שונים המגודלים במעבדתנו העלו הבדלים משמעותיים בתגובת הWoW שלהם. מצאנו כי זן הבר C57BL/6 CBA X המשמש ברוב ניסויי ה- WoW במחקר זה הוא בעל תגובות WU חזקות )ולכן כינינו אותו,)High WoW strain וזאת יחסית לזן הבר C57BL/6 129/Sv X שאינו מראה WoW כלל )ולכן כונה Low.)WoW strain על כן בקשנו לבדוק האם זנים שמראים תגובות שונות ברמת ה- WoW יראו ביטוי דומה ברמת.pERK איור : 23 רמת ביטוי perk בהתאמה עם רמת WoW בשני הזנים. גרפים ימניים )כחול(- קבוצת,low WoW גרפים שמאליים )אדום(- קבוצת.high WoW התגובות בגרף מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של ספירת התאים המסומנים, מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הזנים בשני צידי חוט השדרה measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. מצאנו כי רמת ביטוי התאים המסומנים ב perk בזן High WoW גבוהה משמעותית פי 2.3 בצד האיפסילטרלי [ (1,78)F p<0.0001 ]=24.250; ופי 2.7 בצד הקונטרלטרלי p<0.0001[ ]F(1,78) =16.690; בהשוואה לזן ה Low WoW )איור 51

01(. עובדה זו מראה התאמה בין מידת ה WoW לרמת ה.pERK ידוע כי perk נוצר בתגובה לגירויים נוסיספטים בתוך דקות ובהמשך גורם לשרשרת תהליכים המובילים לרגישות מרכזית ולהגברת התגובה לגירויים נוסיספטיים הבאים. בניסוי זה נמדדה רמת ה- 10 perk דקות מתום סדרת הגירוי הראשונה, הזמן בו ניתנת בד"כ סדרת הגירויים ה 2 nd שמתבטאת בתגובה מוגברת. יתכן כי ניתן להסיק מניסוי זה כי נדרשת רמת סף מסוימת של perk עבור יצירת הגברה משמעותית בסדרת התגובות הבאות.)WoW( 3.1.3 השפעת חסימה מרכזית על יצירת.WoW קולטני NMDA ממוקמים על גבי הממברנה הפוסט-סינפטית בחוט השדרה והם ידועים בחשיבותם בתהליך ה WU ובתהליך הריגוש המרכזי. אולם לא ידוע מה חלקם של קולטנים אלו בתהליך ההגברה של?WoW לצורך כך השתמשנו בחסם קולטני NMDA לא תחרותי - MK-801 בהזרקה סיסטמית בריכוז גבוה.)1mg/kg( ההזרקות בוצעו 30 דקות לפני תחילת סדרות הגירויים כדי לתת לחסם זמן להתפזר ברקמות ולפעול על קולטני ה.NMDA בקבוצת הביקורת הוזרק סליין /1 דקות לפני הגירויים. איור : 24 חסימת קולטני NMDA מונעת WU ו-.WoW פאנל A: סכמת מהלך הניסוי. גרף תחתון C- רישום תגובות בקבוצת הביקורת,)control-saline( גרף תחתון B- קבוצת ה.MK-801 יש לשים לב כי בגרף ימין סקלת ערכי ה- Y קטנה בחצי לצורך רזולוציה גבוהה יותר. התגובות בגרף מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. בקבוצת הביקורת )Saline( נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.022>p (2,18)F[ ;6.379= כלומר נוצר,WoW וכן נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.0001>p (19,171)F[. ;21.350= כמו כן נמצאה אינטראקציה בין גירויים לסדרה [ (38,342)F 50

(1,9)F [ נמצא הבדל מובהק בין הסדרה ראשונה לסדרה השנייה )contrast test( בניתוח קונטרסט ;4.954=[. 0.011>p.]F(1,9) =7.383; p<0.023[ והשלישית ]=5.574; p<0.043 בקבוצת הניסוי )MK-801( לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.429>p (2,14)F[ ;0.899= כלומר שלא נוצר,WoW לעומת זאת נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.0001>p (19,133)F[ ;3.371= משמע שנוצר.WU כמו כן נמצאה אינטראקציה בין גירויים לסדרה ]0.011>p (38,266)F[. ;2.214= בניתוח קונטרסט test( )contrast לא נמצא הבדל מובהק בין הסדרה הראשונה לסדרה השנייה ]0.326>p (1,7)F[ ;1.114= או השלישית ]0.358>p (1,7)F[. ;0.966= בהשוואה בין קבוצת הניסוי )MK-801( לבין קבוצת הביקורת )Saline( נמצא אפקט עיקרי לסדרה מעבר לטיפולים ]0.017>p (2,32)F[ ;5.910= כלומר שקיים דפוס ה WoW בקבוצות. בנוסף נמצא אפקט עיקרי לגירויים מעבר לטיפולים ]0.0001>p (19,304)F[ ;20.260= כלומר שנוצר WU בשתי הקבוצות. בניתוחי קונטרסט test( )contrast נמצא הבדל בין הסדרה הראשונה לשנייה ]0.028>p (1,16)F[ ;5.817= והשלישית ]0.018>p (1,16)F[ ;6.992= מעבר לטיפולים, עובדה התומכת בכך שנוצר דפוס WoW בשני הטיפולים. אולם נמצא הבדל משמעותי באפקט העיקרי בין הקבוצות מעבר לגירוי והסדרה ]0.003>p (1,16)F[ ;12.077= כלומר הבדל משמעותי בממוצעי תגובות הקבוצות. לסיכום: חסימת קולטני NMDA הביאה להפחתה משמעותית בתגובות ולכן הקבוצות שונות משמעותית. אולם למרות שחסימת קולטני ה- NMDA גרמה לביטול תגובת ה- WU בסדרה הראשונה כפי שצפוי, בסדרות הבאות נוצר, בניגוד לצפוי WU מובהק )כפי שנמצא באפקט העיקרי לגירויים(. לכן כפי שניתן להתרשם באיור 04 )גרף B( ובהשוואה בין הקבוצות, נוצר דפוס WoW דומה בשתי הקבוצות. היות שריכוז האנטגוניסט בניסוי זה הינו גבוה )1mg/kg( ניתן לשער כי התרומה ליצירת ה- WU בסדרות הבאות אינה מפעילות קולטני NMDA אלא דרך מנגנונים אחרים. 3.1.1 השפעת חסימה מרכזית על שימור WoW על מנת לבחון האם ניתן להפוך )reverse( את רמת ההגברה לאחר שכבר נוצרה, בדקנו מה תהיה השפעת חסם קולטני ה- NMDA במידה ויינתן לאחר ביסוס ה- WU המוגבר. בניסוי זה החסם ניתן מיד אחרי סדרת הגירויים השנייה. בהמשך ניתנה סדרה שלישית ו- 30 דקות נוספות לאחר מכן ניתנה סדרה רביעית כפי שמתואר באיור 05 A. 51

איור : 25 חסימת רצפטורי NMDA אחרי התפתחות.WU החסימה מחזירה את תגובת ה WU לרמה הראשונית. פאנל A- סכמת מהלך הניסוי. פאנל B- קבוצת הביקורת,)control-saline( פאנל C- קבוצת.MK-801 מוצגים ממוצעי הסדרות בגרף עמודות על מנת להתרשם בקלות מתהליך ההגברה. החץ האדום בגרפים B,C מסמן את זמן ההזרקה. בפינה הימנית העליונה של כל גרף עמודות מוצג גרף עקומות ה WU המקורי. התגובות בגרף מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. בקבוצת הביקורת,Saline( איור 05B( נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.047>p (3,18)F[ ;4.600= כלומר נוצר.WoW בניתוח קונטרסט test( )contrast נמצא הבדל מובהק בין הסדרה הראשונה לסדרה השלישית ]0.032>p (1,6)F[ ;7.767= והרביעית p<0.046[.]f(1,6) =6.295; בקבוצת הניסוי,MK-801( איור 05C( נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.012>p (3,21)F[ ;7.153= כלומר שנוצר WoW ובנוסף נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.0001>p (19,133)F[ ;17.300= משמע שנוצר.WU בניתוח קונטרסט ( contrast (1,7)F [ והשלישית (1,7)F[ ;13.272= ]0.008>p נמצא הבדל מובהק בין הסדרה הראשונה לסדרה השנייה )test.]f(1,7) =1.193; p<0.311[ אך לא לרביעית,]=8.542; p<0.022 בהשוואה בין קבוצת הניסוי )MK-801( לבין קבוצת הביקורת )Saline( נמצא אפקט עיקרי לסדרה מעבר לטיפולים ]0.001>p (3,39)F[. ;9.485= לא נמצאה אינטראקציה בין סדרה לטיפולים ]0.095>p (3,39)F[ ;2.570= משמע שהקבוצות אינן שונות מבחינת התפתחות הסדרות. בנוסף נמצא אפקט עיקרי לגירויים מעבר לטיפולים ]0.001>p (19,247)F[, ;15.694= כלומר שנוצר WU בשתי הקבוצות. האינטראקציה בין גירויים לטיפולים מראה שאין הבדל בין הקבוצות בתגובה לגירויים ]0.450>p (19,247)F[. ;0.699= לא נמצאה אינטראקציה משולשת בין גירויים לסדרה ולטיפולים ]0.393>p (57,247)F[. ;1.016= בניתוחי קונטרסט test( )contrast נמצא הבדל מובהק בין הסדרה 54

הראשונה לשנייה p<0.002[ ]F(1,13) =15.668; והשלישית p<0.003[ ]F(1,13) =13.452; והרביעית [ F(1,13) 0.015>p ;7.927=[ מעבר לטיפולים. לא נמצאו אינטראקציות בין סדרה וטיפולים כלומר שהסדרות אינן שונות בין הטיפולים. בנוסף לא נמצא אפקט עיקרי בין הקבוצות מעבר לגירוי והסדרה ]0.276>p (1,13)F[, ;1.296= כלומר שאין הבדל משמעותי בין הקבוצות. 3 rd לסיכום: הסדרה ה- )/1 דקות לאחר הזרקת החסם( לא מושפעת מחסימת קולטני ה- NMDA ונשארת גבוהה. אולם, הסדרה רביעית )40 דקות לאחר ההזרקה( מופחתת לרמת הבסיס. שינוי זה בין הסדרה השלישית לרביעית מבטא קרוב לודאי, את הקינטיקה של פיזור ופעילות החסם עד הגעתו לרמת פעילות מקסימלית. החסם לא מפחית מעוצמת התגובה הבסיסית )התגובה הראשונה בכל סדרה( אולם הממצא העיקרי של ניסוי זה הוא שפעילות קולטני ה- NMDA חיונית גם אחרי ביסוס ההגברה, ומכאן שהיא חיונית לשימור ה- WoW. 3.1 התנהגות כאב בעקבות גירויי.wind-up 3.1.0 האם סדרות הגירויים משפיעות על התנהגות כאב? תופעת ה wind-up הינה תופעה אלקטרופיסיולוגית שההשפעה ההתנהגותית שלה לא נבחנה באופן שיטתי למיטב ידיעתנו. הדגמת הקשר בין תופעה זו לבין התנהגות כאב יכולה לתמוך בחשיבות מודל זה ולהוסיף מימד שיאפשר להשתמש במודל לבחינת מנגנוני כאב ובדיקת השפעת חומרים פרמקולוגיים. איור : 26 סכמת מהלך ניסוי ההשפעה ההתנהגותית של גירוי.wind-up מטרת הניסוי לבחון האם גירוי WU יכול להגביר את הרגישות לכאב בתגובה לגירויי מגע )tactile( או חום?)thermal( החיות נבדקו בשבוע שלפני הגירוי לצורך הערכת תגובת הבסיס שלהן, ושוב אחרי הגירוי להערכת ההשפעה ההתנהגותית של.WU במהלך הגירוי החשמלי החיות הורדמו בכלוראל הידראט i.p.( 4%,)0.5g/kg, מינון שכויל עבור הרדמה יציבה לרישום WoW אבל מבטיח שהחיות יתעוררו בתום הגירוי לצורך המדידה ההתנהגותית. תוצאות מקדימות הראו שבמינון זה החיות מתעוררות לחלוטין בתוך 3.5-4 שעות(. המדידה ההתנהגותית הראשונה נעשתה 7 שעות אחרי הגירוי ובהמשך ב 24 ו- 48 שעות לאחר הגירוי )איור 06(. 55

Gram (von-frey) Time to withdraw (sec) 6 Wind-up trains induces tactile allodynia 6 Wind-up trains induces thermal hyperalgesia 5 4 3 2 1 0 * * Base line 7 H 24 H 48 H Time Base-line 1t left 1t right 2t left 2t right 3t left 3t right 5 4 3 2 1 * * Base line 4H 24H 48h Time Base-line t 1 left t 1 right t 2 left t 2 right t 3 left t 3 right איור : 27 סדרת גירויי wind-up גורמת להתנהגות כאב. גרף שמאלי- מדידת רגישות למגע test( )von-frey, גרף ימני מדידת רגישות לחום test(.)hargreaves סימונים: שחור-סדרת גירויים אחת, כחול- שתי סדרות גירוי, ירוק- שלוש סדרות גירוי. מדידת תגובה למגע מוצגת בגרם ואילו מדידת תגובה לחום מוצגת בשניות זמן חימום. הנתונים מוצגים כממוצע S.E.M(,)mean ± מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין המדידות בזמנים השונים לבין ממוצע מדידת הבסיס בניתוח שונות עם מדידות חוזרות ( with ANOVA.)repeated measures סימן * מייצג הבדל מובהק מרמת הבסיס. במדידת הרגישות לחום )איור 11 ימין(: מצאנו אפקט עיקרי לרגל ]0.0001>p (1,0.63)F[, ;71.267= נתון המצביע על הבדל מובהק בין הרגליים מעבר לזמנים. בנוסף אפקט עיקרי לזמן ]0.043>p (3,63)F[, ;2.995= המראה הבדל מובהק בזמנים מעבר לרגליים. נמצאה אינטראקציה בין רגליים וזמנים ]0.0001>p (3,63)F[, ;15.868= אולם אין אינטראקציה משולשת בין רגלים,זמן וסדרה ]0.093>p (6,21)F[ ;2.150= עובדה המצביעה על כך שהסדרות דומות. בדיקת קונטרסט תוך נבדקי של ממוצע שתי הרגליים מראה הבדל מובהק בין מדידת הבסיס ל 7 שעות ]0.013>p (1,21)F[, ;7.290= ל 04 שעות p<0.022[,]f(1,21) =6.113; אך לא עבור 48 שעות p<0.525[.]f(1,21) =0. 418; בדיקת קונטרסט לאינטראקציה רגל וזמן בודקת את הרגליים בנפרד לאורך הזמן, מראה הבדל מובהק בין מדידת הבסיס ל 7 שעות [ (1,21)F F(1,21) =8.689; [ ואף ב 48 שעות ]F(1,21) =163.541; p<0.0001[ וכן ב 04 שעות ]=23.563; p<0.0001 0.008>p[. במבחן בין נבדקי לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.930>p (2,21)F[ ;0.73= כלומר שאין הבדל בין הסדרות. במדידת הרגישות למגע )איור 11 שמאל(: מצאנו אפקט עיקרי לרגל ]0.0001>p (1,0.21)F[, ;23.531= נתון המצביע על הבדל מובהק בין הרגליים מעבר לזמנים. בנוסף אפקט עיקרי לזמן ]0.001>p (3,63)F[, ;11.928= המראה הבדל מובהק בזמנים מעבר לרגליים. נמצאה אינטראקציה בין רגליים וזמנים ]0.0001>p (3,63)F[, ;16.476= אולם אין אינטראקציה משולשת בין רגלים,זמן וסדרה ]0.637>p (6,21)F[ ;0.718= עובדה המצביעה על כך שהסדרות דומות. בדיקת קונטרסט תוך נבדקי של ממוצע שתי הרגליים מראה שאין הבדל בין מדידת הבסיס ל 7 שעות [ ;1.581= (1,21)F (1,21)F [ אך לא עבור 48 שעות (1,21)F[, ;14.101= ]0.001>p לעומת הבדל משמעותי ב 04 שעות 0.222>p[, 0.163>p ;2.089=[. בדיקת קונטרסט לאינטראקציה רגל וזמן בודקת את הרגליים בנפרד לאורך הזמן, מראה הבדל מובהק בין מדידת הבסיס ל 7 שעות ]0.0001>p (1,21)F[ ;28.869= וכן ב 04 שעות ]0.0001>p (1,21)F[ ;22.707= אך אין הבדל ב 48 שעות ]0.953>p (1,21)F[. ;0.004= במבחן בין נבדקי לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה [ ;0.727= (2,21)F.0>p[, 495 כלומר שאין הבדל בין הסדרות. 56

לסיכום, מצאנו כי חיות אשר גורו בסדרת גירוי אחת )WU( פיתחו רגישות מוגברת למגע למשך 24 שעות לפחות ורגישות לחום למשך 48 שעות לפחות. ציפינו לתגובה התנהגותית עוד יותר מוגברת אצל חיות שנחשפו בנוסף לסדרה הראשונה גם ל 0 או 1 סדרות של גירויים, כשיקוף של תגובת ה,WoW אולם מצאנו כי אין הבדל בין הגברת הכאב שנרשמה לאחר סדרה אחת של גירוי לבין זו שנרשמה בקבוצות שקיבלו 2 או 3 סדרות )איור 07(. שלוש קבוצות הניסוי הראו התנהגות כאב מוגברת ודומה. יתכן כי ניתן להסיק מניסוי זה כי התהליך העיקרי מבחינת יצירת הריגוש המרכזי מתרחש במהלך ובעקבות הסדרה הראשונה וכי הסדרות הבאות משקפות את ההשפעה של הגירוי הראשון אך לא מגבירות את האפקט תחושת הכאב. 3.1.1 האם חסימת קולטני NMDA תשכך את התנהגות הכאב? ראינו כי חסימת קולטני NMDA באמצעות MK-801 מונעת את תגובת ה WU ואת יצירת ה-,WoW ואף חוסמת אותו לאחר שנוצר. לכן בניסוי הנוכחי בדקנו האם שימוש במינון דומה של MK-801 )1mg/kg( יכול להשפיע על התנהגות הכאב לאחר הגירוי. בניסוי זה השתתפו שלוש קבוצות )כמוצג באיור 08(. כל הקבוצות נבדקו בשבוע שלפני הגירוי לצורך הערכת רגישות הבסיס שלהן למגע וחום. איור : 28 סכמת מהלך ניסוי השפעת MK-801 על התנהגות כאב בעקבות גירוי.Wind-up על פי תוצאות מדידות הבסיס החיות חולקו לשלוש קבוצות בעלות רגישויות דומות. כפי שניתן לראות באיור 08, קבוצה 1( קבוצת ה- sham הוזרקה בסליין /1 דקות לפני גירוי sham אשר כלל הרדמה והחדרת אלקטרודות הגירוי ללא שלב הגירוי אך למשך אותו פרק זמן של גירוי. קבוצה 0( Saline-Windup הוזרקה בסליין /1 דקות לפני סדרת גירוי Windup אחת. קבוצה 1( Windup MK-801 הוזרקה ב MK-801 )1mg/kg( /1 דקות לפני סדרת גירוי Windup אחת. הזרקות הסליין נעשו בנפח זהה להזרקת ה.MK-801 כל החיות נבדקו לרגישות למגע וחום 7 שעות מהגירוי, זמן שבו מצאנו קודם לכן רגישות למגע וחום בעקבות גירוי wind-up ו 26 שעות מהגירוי, פרק זמן בו נמצא שרמת הרגישות חזרה לרמת הבסיס. חלק נוסף של הניסוי נערך שבעה ימים לאחר הגירוי והוא יתואר בהמשך. 57

Gram (VF) Secound to withdraw 5 sham Saline-Windup MK-801- Windup 4 NMDA antagonist blocks tactile sensitivity Thermal sensitivity is not influenced by NMDA antagonist 5 sham Saline-Windup MK-801-Windup 4 3 3 2 1 * 2 1 * * 0 Base line 7 H 96 H 0 Base line 7 H 96 h Time Time איור : 29 טיפול בחסם NMDA מנע רגישות למגע אך לא לחום. גרף שמאל: מדידת רגישות לגירוי מגע, גרף ימין: מדידת רגישות לגירוי חום. הקבוצות בניסוי זה הן: 1- Sham )7=n(, 2- Saline-Windup.MK-801-Windup 3- )8=n(, נתוני תגובה למגע מוצגת בגרם ואילו נתוני תגובה לחום מוצגים בשניות זמן חימום. הנתונים מוצגים כממוצע S.E.M(,)mean ± מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין המדידות בזמנים השונים לבין ממוצע מדידת הבסיס בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated סימן * מייצג הבדל מובהק מרמת הבסיס. תוצאות: במדידת הרגישות למגע )איור 02 גרף שמאל( מצאנו אפקט עיקרי לזמן ]004.0>p,2)F[ (42 ;6.453= נתון המצביע על הבדל מובהק ברגישות למגע בזמנים השונים מעבר לטיפולים. בנוסף נמצאה אינטראקציה בין זמן וטיפול [,4)F,1)F (21 [ (42[. בדיקת קונטרסט תוך-נבדקי מראה הבדל מובהק בין מדידת הבסיס ל 7 שעות ;2.842=.0>p 036.0>p 004 ;10.485=[, אולם אין הבדל בין מדידת הבסיס ל 26 שעות ]568.0>p,1)F[. (21 ;0.336= במבחן בין-נבדקי נמצא אפקט עיקרי לטיפול ]0.037>p (2,20)F[, ;3.915= כלומר שיש הבדל בין הטיפולים השונים. בדיקת הקבוצות השונות: בקבוצת ה Sham לא נמצא אפקט עיקרי לזמן ]605.0>p,2)F[ (14 ;0.522= ובנוסף לא נמצא הבדל בבדיקת קונטרסט בין-נבדקי בין מדידת הבסיס ל 7 שעות או 26 שעות 367[ p<0. ]F(1, 14) =0.928; ו- [ =0.420; 14) F(1,,2)F [ נמצא אפקט עיקרי לזמן saline-windup בהתאמה, כלומר שלא נוצרה רגישות לאורך הניסוי. בקבוצת.0>p[ 537.0>p 0001 ;29.545= (14[ ובנוסף נמצא הבדל בבדיקת קונטרסט בין נבדקי בין מדידת הבסיס ל 7 שעות אך לא ב- 26 שעות 0001[ p<0. ]F(1, 14) =49.193; ו- p<0.193[ ]F(1, 14) =2.078; בהתאמה, כלומר נמצאה רגישות מוגברת למגע ב 7 שעות אך היא חלפה בבדיקה של 26 שעות. בקבוצת MK-WU לא נמצא אפקט עיקרי לזמן [ ;0.840= (14,2)F,1)F (14 [ ובנוסף לא נמצא הבדל בבדיקת קונטרסט בין-נבדקי בין מדידת הבסיס ל 7 שעות ו- 26 שעות.0>p[ 453.0>p 317 ;1.159=[ ו- ]0.255>p,1)F[ (14 ;1.537= בהתאמה, כלומר שלא נוצרה רגישות למגע בקבוצה זו. בדיקת הקבוצות השונות במדידת הרגישות לחום )איור 02 גרף ימין(: בקבוצת ה Sham לא נמצא אפקט עיקרי לזמן ]133.0>p,2)F[ (12 ;2.400= ובנוסף לא נמצא הבדל בבדיקת קונטרסט בין-נבדקי בין מדידת הבסיס ל 7 שעות או 26 שעות 213[ p<0. ]F(1, 14) =1.938; ו- 329[ p<0. ]F(1, 14) =1.126; בהתאמה, כלומר שלא נוצרה רגישות לחום לאורך הניסוי בקבוצה זו. בקבוצת saline-windup נמצא אפקט עיקרי לזמן ]0001.0>p,2)F[ (14 ;12.199= ובנוסף נמצא הבדל בבדיקת קונטרסט בין-נבדקי בין מדידת הבסיס ל 7 שעות אך לא ב- 26 שעות ]002.0>p,1)F[ (14 ;24.921= ו- ]0.346>p,1)F[ (14 ;1.022= בהתאמה, כלומר שנמצאה רגישות לחום ב 7 שעות אך לא ב 26 שעות. בקבוצת MK- 58

AUC (mv X ms) AUC (mv X ms) AUC (mv X ms) WU נמצא אפקט עיקרי לזמן ]001.0>p,2)F[ (14 ;11.793= ובנוסף נמצא הבדל בבדיקת קונטרסט בין נבדקי בין מדידת הבסיס ל 7 שעות אך לא ב- 26 שעות 0001[ p<0. ]F(1, 14) =79.582; ו- p<0.238[ ]F(1, 14) =1.663; בהתאמה, כלומר שנוצרה רגישות לחום לאחר 7 שעות מהגירוי שחלפה עד מדידת ה 26 שעות, בקבוצה זו. לסיכום, קבוצת ה sham כצפוי, לא הראתה סימני התנהגות כאב, קרי רגישות מוגברת למגע וחום לאורך הניסוי. קבוצת ה Saline-Windup הראתה רגישות מוגברת למגע ולחום לאחר 7 שעות מהגירוי. קבוצת MK-801-Windup לא פיתחו אלודיניה למגע כלל אולם הראו רגישות מוגברת לחום 7 שעות מהגירוי )איור 02(. לאחר 26 שעות מהגירוי כל הקבוצות חזרו לערכי הבסיס. תוצאה זו מלמדת כי חסימת קולטני NMDA לפני גירוי windup עשויה להפיג אלודיניה לגירוי מכאני אך אין לה השפעה על גירוי תרמי. 3.1.1 בדיקת משך השפעת הגירויים על תגובות WoW לאחר 7 ימים מגירוי.WU החיות המתוארות בניסוי הקודם )איורים 08 ו- 02 ( הראו רגישות למגע ולחום )או רק לחום במידה וטופלו ב )MK-801 7 שעות מגירוי ה WU ולאחר 4 ימים )26 שעות( מהגירוי כבר לא הראו התנהגות כאב. בדקנו מה יהיו תגובות ה WoW של הקבוצות הללו לאחר שבעה ימים מהגירוי. כפי שניתן להתרשם באיור /1,בחיות קבוצת ה sham נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]033.0>p,2)F[ (12 ;6.822= משמע שנוצר,WoW כמו כן נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.002>p (19,114)F[, ;10.823= כלומר הבדל מובהק בתגובה בתוך הסדרות, משמע שנוצר.WU בנוסף נמצאה אינטראקציה בין גירויים לסדרה ]0.019>p (38,228)F[. ;5.444= קבוצת ה 1 st מוגברת - הסדרה ה WoW הראתה תגובת Saline-Windup כבר נראית מוגברת. בקבוצה זו, לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]080.0>p,2)F[ (14 ;3.043= משמע שלא נראית הגברה בין הסדרות.)WoW( לעומת זאת נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.0001>p (19,133)F[ ;19.288= ובנוסף נמצאה אינטראקציה בין גירויים לסדרה [ ;2.267= (38,266)F 0.0001>p[. בקבוצת ה MK-801-Windup לא נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]628.0>p,2)F[ (12 ;0.311= משמע שאין הבדל בין הסדרות. לעומת זאת נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.0001>p (19,114)F[ ;23.777= כלומר שנוצר.WU כמו כן אין אינטראקציה בין גירויים לסדרה ]449.0>p (38,228)F[ ;0.818= דבר המצביע על הדמיון בהתפתחות הסדרות. בקבוצה זו נוצר בכל הסדרות WU המתאים בעוצמתו לרמה של סדרה ראשונה ללא הגברה בין סדרתית. במבחן השוואה בין נבדקי נמצא אפקט עיקרי בין הקבוצות ]023.0>p (2,19)F[, ;4.608= כלומר הבדל מובהק בין הקבוצות. בבדיקת קונטרסט נמצא הבדל מובהק בין קבוצת Saline-Windup ל- (1,13)F[. ;6.731=.0>p ]022 MK-801-Windup לא נמצא הבדל מובהק בין קבוצת ה sham לשתי הקבוצות האחרות. Sham group Saline-Windup group MK801-Windup group 10.0 7.5 5.0 1st # 2nd 3rd * * 10.0 7.5 5.0 10.0 7.5 5.0 1st 2nd (ns) 3rd (ns) 2.5 0.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus n=7 1st 2.5 2nd (ns) 3rd (ns) 0.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus n=8 2.5 0.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus n=7 איור : 30 התגובות המוגברות נשמרות שבוע אחרי הגירוי. 52

הקבוצות בניסוי זה הן: 1-,Saline.MK-801-Windup 3-,Saline-Windup 2- התגובות בגרף מוצגות כממוצע ( mean ±( S.E.M של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. התגובות בקבוצת Saline-Windup מלמדות כי המידע הנוסיספטי עשוי להישמר זמן רב )ריגוש ארוך טווח( לאחר סדרת גירוי WU בודדת. יש לציין כי הרגישות לגירויי מגע וחום חזרה כבר מוקדם יותר )26 שעות( לרמת הבסיס בכל הקבוצות )איור /1(. עובדה זו מצביעה ככל הנראה על ספציפיות לסוג הגירוי המכונן )גירוי חשמלי(. באופן דומה, שימוש באנטגוניסט לקולטני NMDA כחסם שמנע את ההתפתחות )preemptive( של הריגוש המרכזי בחוט שדרה מביא לדיכוי ארוך טווח )LTD( בתגובות לסוג הגירוי המכונן. 3.4 מעורבות תאי גליה בתהליך ה.WoW 3.4.0 האם תאי מיקרוגליה מעורבים ביצירת ה?WoW ידוע כי הפעלת נוסיספטורים עשויה לשפעל תאי מיקרוגליה אשר בהמשך עשויים לתרום להגברת תהליך הריגוש המרכזי, בין היתר על ידי שחרור ציטוקינים, דוגמת אינטרלאוקין- 1.)IL-1( על מנת לבחון מעורבות של תאי מיקרוגליה טיפלנו בחיות במעכב האנטיביוטי מינוציקלין לפני סדרת הגירוי הראשונה. מינוציקלין הוא חומר אנטיביוטי בעל שומניות גבוהה ביותר ועל כן נחשב כבעל חדירות גבוהה ל-.CNS למעט פעילותו האנטי-מיקרוביאלית הוא ידוע בפעילות נוירו-פרוטקטיבית ככל הנראה בשל פעילות אנטי-דלקתית. מנגנון פעילות זו מתווך ע"י חסימת פעילות של גורם השיעתוק הפרו-דלקתי NF-kB ובעקבות כך הפחתה ביצירת ציטוקינים פרו-דלקתיים. איור : 31 סכמת מהלך ניסוי השפעת מינוציקלין על.WoW החומר הוזרק )במינון i.p. (30mg/kg, שלוש פעמים בזמנים 12, 24, ו- 1 שעות לפני הגירוי הראשון. זמני ההזרקה מצויינים בחצים סגולים. 6/

AUC (ms X mv) AUC (ms X mv) 12 10 8 6 4 2 Control group (saline) 1st # 2nd * 3rd 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus 12 1st 10 8 6 4 2 Minocycline group # 2nd 3rd * 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus n=7 n=8 איור : 32 טיפול מקדים עם מינוציקלין לא מנע אך הפחית WoW באופן משמעותי. התגובות בגרף מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. בניסוי זה השתמשנו בפרוטוקול הזרקה מקדים )preemptive( מקובל ]151, 150[, באופן שריכוזו של המינוציקלין בדם נשמר גבוה בזמן הניסוי )זמני ההזרקה מתוארים באיור 11(. בהשוואה בין קבוצת המינוציקלין לבין קבוצת הביקורת נמצא אפקט עיקרי לסדרה מעבר לטיפולים ]0.025>p (2,26)F[. ;6.113= בדיקת אינטראקציה בין סדרה לטיפולים [ (2,26)F 0.135>p ;2.501=[ משמע שהקבוצות אינן שונות מבחינת התפתחות הסדרות. בנוסף נמצא אפקט עיקרי לגירויים מעבר לטיפולים ]0.002>p (19,247)F[ ;10.270= כלומר שנוצר WU בשתי הקבוצות. בניתוח קונטרסט test( )contrast נמצא הבדל בין הסדרה הראשונה לשנייה ]0.015>p (1,13)F[ ;7.901= והשלישית ]0.038>p (1,13)F[. ;5.346= נמצא הבדל משמעותי באפקט העיקרי בין הקבוצות מעבר לגירוי והסדרה ]0.027>p (1,13)F[, ;6.176= כלומר שהקבוצות שונות באופן מובהק. בדיקת הקבוצות בנפרד: בקבוצת הביקורת )Saline( נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.057>p (2,12)F[, ;5.313= כלומר נוצר WoW וכן נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.047>p (19,114)F[. ;4.916= בניתוח קונטרסט test( )contrast נמצא הבדל מובהק בין הסדרה הראשונה לסדרה השנייה ]0.040>p (1,6)F[ ;6.870= אך לא לשלישית [ ;4.710= (1,6)F.]p<0.073 בקבוצת הניסוי )minocycline( נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.019>p (2,14)F[, ;7.898= כלומר שנוצר WoW ובנוסף נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.009>p (19,133)F[ ;10.524= משמע שנוצר.WU בניתוח קונטרסט test( )contrast תוך נבדקי נמצא הבדל מובהק בין הסדרה הראשונה לסדרה השנייה ]0.025>p (1,7)F[ ;8.069= ולשלישית [ (1,7)F.]=10.197; p<0.015 לסיכום: כפי שניתן לראות באיור 10, התוצאה העיקרית של ניסוי זה היא כי למרות שבשתי הקבוצות נוצרה הגברה בין סדרתית )WoW( הטיפול עם מינוציקלין הביא להנחתה חזקה בתגובות ה windup בכל הסדרות. 3.5 האם הגברת ה WoW נובעת משחרור ופעילות אינטרלאוקין- 1 אנדוגני? הציטוקין IL-1 ידוע כמעורר כאב כשהוא מוזרק לפריפריה ו 0 או למערכת העצבים המרכזית. הציטוקין מופרש בתהליכי דלקת, ובמערכת העצבים המרכזית ע"י תאי גליה, מיקרוגליה ואסטרוציטים, וממלא תפקיד חשוב בתהליך הרגישות המרכזית. 61

בדקנו האם אינטרלאוקין- 1 אנדוגני מתווך את ההשפעה של המיקרוגליה על הגברת ה.WoW לשם כך השתמשנו ב IL-1ra המיוצר בגוף כחלק ממנגנון הבקרה של.IL-1 חסם ספציפי לרצפטורים של IL-1 (interleukine-1 receptor antagonist) האנטגוניסט )או סליין( הוזרק 30 דקות לפני הגירוי הראשון, טווח זמן הדרוש לחומר להגיע לרמה מקסימלית בנוזל ה CSF כפי שנמצא בעבר ]145, 146[. איור : 33 מתן IL-1ra סיסטמי לא מפחית תגובות.WoW פאנל A הינו תיאור סכמטי של מהלך הניסוי. הגרפים התחתונים מייצגים את קבוצת הזרקת. IL-1ra גרף B- )mean ± S.E.M( )קבוצת הביקורת סליין לא מוצגת(. התגובות בגרף מוצגות כממוצע 100mg/kg C- וגרף 200mg/kg של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. בהשוואה בין הקבוצות נמצא כי נוצרה הגברה בין סדרתית בשתיהן ]002.0>p (2,22)F[ ;13.424= כלומר שנוצר.WoW לא נמצא הבדל בין קבוצות האנטגוניסט לבין קבוצת הביקורת ]956.0>p (1,11)F[. ;0.003= כלומר שהזרקה סיסטמית של האנטגוניסט במינונים אלו, הידועים כפעילים במודלים אחרים של כאב, לא הביאה להפחתה או ביטול ה WoW )איור 11(. מסקנות אפשריות מניסוי זה: 1( IL-1 אנדוגני לא משתתף בתהליך ה.WoW יתכן שציטוקינים אחרים כדוגמת TNF-α פעילים ויכולים לספק הסבר לניסוי חסימת המיקרוגליה. 60

AUC (mv X ms) AUC (mv X ms) IL-1 אנדוגני כן משתתף בתהליך ה WoW אולם האנטגוניסט לא הגיע ברמה מספקת לחוט השדרה )או שזמן החסימה אינו מספיק(, ולכן לא התבצעה חסימה של.IL-1 כדי לבדוק זאת יש צורך להזריק את האנטגוניסט לחוט השדרה. )0 3.5.0 האם חסימה ממושכת של IL-1 במערכת העצבים משפיעה על יצירת ה?WoW כדי לברר שאלה זו השתמשנו בזן מוטנטי )שזן הבר שלו הוא הזן ששימש אותנו בכל ניסויי ה WoW שנזכרו עד כה(. הזן המוטנטי (IL-1raTG) מהונדס גנטית באופן שבו גן ה IL-1ra מצומד לגן GFAP המבוטא באסטרוציטים. כך שבמצב נורמלי קיים ייצור בזאלי מוגבר של IL-1ra ובעת הפעלה אסטרוציטית ייצור IL-1ra מוגבר עוד יותר. 5 1st # 2nd 4 * 3rd 3 2 1 * WT group 5 1st # 2nd 4 * 3rd 3 2 1 * IL-1ra TG group 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus n=11 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus n=7 איור : 34 חסימה מרכזית כרונית של IL-1 לא מפחיתה תגובת.WoW התגובות בגרף מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. בניסוי זה זן הבר והזן המוטנטי הראו WoW ולא נמצא הבדל משמעותי בין תגובות הקבוצות [ ;0.033= (2,18)F.WoW במערכת העצבים המרכזית לא חוסמת 14(. מכך אנו למדים כי חסימה ממושכת של IL-1 )איור 0.967>p[ מסקנתנו מניסוי זה היא שככל הנראה IL-1 אינו בעל תפקיד במנגנון הגברה זו. 3.3 האם גירויים נוסיספטים 'טבעיים' משפיעים על תגובת ה?WoW 3.3.0 האם גירוי תרמי מקדים משפיע על דפוס ה?WOW בניסוי הבא בדקנו את ההשפעה של גירויים תרמיים קודמים לגירוי ה WoW כגירוי 'טיבעי' מקדים. בניסוי זה החיות המורדמות קובעו לסט הרישום כולל אלקטרודות.EMG בהמשך גירינו את השדה הרצפטיבי המתאים בכף הרגל ע"י אלומת אור ממוקדת שלוש פעמים במרווח של 2 דקות בין גירוי לגירוי )איור A(. 15 כדי למנוע נזק לרקמה )כוויה( גירויי החום הופסקו ברגע שהתקבלה תגובת רפלקס כפי שניתן לראות באיור B. 15 מצאנו כי גירויי החום הביאו את העקומה הראשונה לצורת עקומת רוויה )איור C(. 15 ניתן לומר כי גירוי החום "החליף" את הסדרה הראשונה מבחינת יצירת הריגוש המרכזי. 61

איור : 35 גירוי חום מקדים יוצר תגובת WoW כבר לגירוי החשמלי הראשון. פאנל A: תיאור סכמטי של מהלך הניסוי. פאנל B: רישום מקורי של תגובת רפלקס לגירוי החום. עם זיהוי תגובת הרפלקס הגירוי הופסק על מנת שלא לפגוע ברקמת העור. פאנל C: גרף תגובת ה WoW לאחר הגירוי. התגובות בגרף מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. באופן גירוי זה נמצא אפקט עיקרי לסדרה ]0.015>p (2,24)F[ ;6.554= כלומר שקיים הבדל בין הסדרות. וכן נמצא אפקט עיקרי לגירויים ]0.0001>p (19,228)F[. ;13.039= בניתוח קונטרסט test( )contrast נמצא הבדל מובהק בין הסדרה הראשונה לסדרה השנייה ]0.010>p (1,12)F[ ;9.340= ולשלישית ]0.026>p (1,12)F[, ;6.448= כלומר שהתגובות בסדרה הראשונה חזקות משמעותית מהסדרות הבאות. ניסוי זה מלמד כי ניתן ליצור סדרה ראשונה מוגברת ע"י החלפת הגירוי החשמלי בגירויים תרמיים המשרים ריגוש מרכזי. 3.3.1 האם טיפול מקדים במודל 'כאב לאחר ניתוח' model( )Brennan משפיע על דפוס ה?WOW לצורך הבנת מנגנוני כאב לאחר ניתוח בבני אדם, פותח מודל ייחודי במכרסמים, בו נעשה חתך בכף הרגל האחורית של המכרסם ולאחר מכן נמדדת הרגישות לכאב באזור הניתוח. מדידת הכאב לפני ואחרי הניתוח מאפשרת לבחון את היעילות של תרופות משככות כאב לאחר הניתוח. בנוסף, מודל זה מאפשר לימוד מנגנוני כאב המתפתחים בעקבות פרוצדורות ניתוחיות. הניתוח בכף הרגל האחורית בוצע בהתבסס על מודל החתך הפלנטרי המכונה בספרות ]151[. Brennan model בקצרה, במהלך הניתוח החיה מורדמת בהרדמה מלאה באיזופלוראן inhalation(.)isofluorane נעשה חתך בכף הרגל האחורית, כ- 0 מ"מ מהעקב, באורך של כ- 5 מ"מ. החתך חודר את העור, עד לחשיפת הגיד הפלנטרי. בהמשך הגיד מופרד באמצעות 64

AUC (mv X ms) AUC (mv X ms) AUC (mv X ms) פינצטה מעוגלת מהפאציה. החתך חוטא ולא נתפר. לעכבר ניתן זמן להתאושש מההרדמה )כ- 0-4 דקות(. ניתן להתחיל למדוד התנהגות כאב כבר שעה לאחר תום הניתוח )איור 16(. איור 33: סכמת מהלך ניסוי השפעת חתך בכף הרגל על.WoW בניסוי זה נבדקה השפעת החתך בשתי קבוצות ניסוי: 3 שעות ו 13 שעות לפני בדיקת.WoW מדידות התנהגותיות שנעשות לאחר החתך מראות רגישות למגע וחום מיד לאחר הניתוח. רגישות זו נמשכת לפחות 1 ימים ]151-155[. בניסוי הנוכחי מדידת ה WoW נעשתה בשתי נקודות זמנים בטווח הרגישות )1 ו- 04 שעות לאחר החתך(. WoW Sham group WoW 3 hour from plantar incision WoW 48 hour from plantar incision 6 5 4 1st 2nd 3rd # * * 6 5 4 1st # 2nd * 3rd 6 5 4 1st # 2nd * 3rd * 3 3 3 2 2 2 1 1 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num n=14 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num n=7 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus num n=12 איור 33: חתך בכף הרגל אינו משפיע על דפוס ה-.WoW בניסוי זה נבדקה השפעת החתך בשתי קבוצות ניסוי: 3 שעות ו 13 שעות לפני בדיקת.WoW התגובות בגרף מוצגות כממוצע S.E.M( )mean ± של,AUC מובהקות סטטיסטית נבדקה עבור הבדל בין הסדרה הראשונה לסדרות הבאות בניתוח שונות עם מדידות חוזרות measures(.)anova with repeated #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. בניסוי זה )איור 17( שלוש הקבוצות הראו אפקט לסדרה מעבר לטיפולים כלומר דפוס WoW מובהק בכל הקבוצות ]0.0001>p (2,62)F[. ;20.065= תוצאות דומות נמצאו בבדיקת קונטרסט. יתרה מכך, מבחן השוואה בין נבדקי לא נמצא אפקט עיקרי בין הקבוצות ]0.422>p (2,31)F[ ;0.886= כלומר שאין הבדל בין הקבוצות. מכך אנו למדים כי במודל זה של חתך בעור כף הרגל למרות הרגישות המבוטאת בהתנהגות כאב אין שינוי בדפוס ה- WoW. 65

1.1 דיון: במחקר זה מצאנו תופעה ייחודית וחדשה שלא תוארה קודם לכן הקשורה בהבנת מנגנון הריגוש המרכזי. לצורך המחקר פיתחנו ואפיינו פרוטוקול ייחודי המבוסס על סדרות גירוי wind-up )סדרת גירוי נוסיספטי רפטטיבית בתדירות נמוכה המובילה לתגובות הולכות ומתגברות מהנוירונים שבחוט השדרה(. הפרוטוקול מורכב משלוש סדרות WU זהות הניתנות במרווח של /1 דקות בין סדרה לסדרה. הניסויים הראשונים שנערכו עם פרוטוקול הניסוי הנ"ל הראו תגובה מוגברת בתגובות הסדרה השנייה והשלישית בהשוואה לסדרה הראשונה. ממצא זה לא תאם לידוע ממחקרים קודמים, שכן מקובל לחשוב כי משך ההשפעה של גירוי WU הינו עשרות שניות. את תופעת ההגברה בין הסדרות כינינו WoW )קיצור של.)Windup of Windup בחיפוש ממוקד בספרות העוסקת בתחום זה לא מצאנו תיאור דומה של תופעת ה- WoW. עובדה זו מפתיעה בשל המחקר הרב שזכתה לו תופעת ה.wind-up 1. ממצא זה העלה את השאלה מדוע תופעת ה WoW לא תוארה קודם? שאלה זו הפכה לשאלה מרכזית במחקר הנוכחי, לפיכך השלב הראשון בדיון יעסוק בתשובות אפשריות לשאלה זו. בהשוואה שערכנו בין הניסויים שלנו לבין אלו של אחרים שחקרו את תופעת ה wind-up התגלו הבדלים משמעותיים בשיטות העבודה. מצאנו כי בכלל הניסויים שנערכו בעבר ע"י חוקרים אחרים, נגרם נזק רקמתי )ובתוך כך גירוי נוסיספטי( או גירוי נוסיספטי מקדים לחיות, לפני גירוי ה.WU גירוי נוסיספטי מקדים יכול לנבוע ממניפולציות ניתוחיות שונות המבוצעות כהכנה לניסוי הגירוי. מבין השיטות, הטכניקה של ניתוק המוח )decerebration( היוותה שיטה עיקרית בחקר תופעת ה- ]1/7, WU /15, 156-161[. השימוש במודל זה היה בשיאו בשנות ה-/ 8 וה-/ 2 של המאה הקודמת ובעזרתו נתגלו ממצאים רבים וחשובים שבמרכזם גילוי תופעת הרגישות מרכזית במעבדתם של החוקרים פאטריק וול, קליפורד וולף ועמיתיהם P( )Woolf, C.J and Wall,,15/[,16/-160,156.]164-180 מפאת מרכזיותו של מודל זה בגילוי תופעת הרגישות המרכזית בחרנו להתמקד ראשית בהבנתו ובהשלכותיו. במודל ניתוק המוח, הקורטקס והתלמוס ( cortex cerebral )and thalamus מופרדים מגזע המוח ובכך נחסמים כל החושים )תחושות כגון ראיה, שמיעה, הרחה וכן תחושות הכאב ]181[. לאחר תקופת התאוששות )בין מספר שעות ל 1 ימים( החיות מסוגלות ללכת והן נלקחות להמשך הניסוי הכולל בד"כ ניתוחים לחשיפת חוט השדרה ועצבים פריפריים, וכמובן גירויים נוסיספטיים ובדיקת הרגישות לגירויים. שלב זה מתאפשר ללא חומרי הרדמה או שיכוך כאב שכן החיה אינה חווה כאב, זאת על אף שהתהליכים הנוסיספטיים ממערכת העצבית הפריפרית ומערכת העצבים המרכזית בחוט השדרה עד גזע המוח פועלים ]181[. שיטה זו אפשרה ניסויים הכוללים פרוצדורות ניתוחיות נוספות ללא צורך בחומרי הרדמה ובכך ניתן היה לבצע ניסויים ארוכים )משבועות ועד שלושה חודשים( וחוזרים באותה חיה ]178[. אולם לפרוצדורה זו קיימות מספר השלכות שליליות מבחינת מצבה הפיסי של החיה. המידע הרלוונטי ביותר לבחינת מודל זה נמצא במאמרו של Woolf et al 1984 הבוחן את היתכנות המודל עבור מחקר תהליכי כאב ]178[ ומאמרו של ]184[ Woods et al 1964 המתאר התנהגות חיות לאחר ניתוח זה. }עיקרי הממצאים: במחקרים אלה נמצא כי במהלך הניתוח החיות איבדו כמות גדולה של דם )כ 0 מ"ל שהם כשליש מנפח הדם של החולדה( בעיקר מכלי הדם המוחיים ושטפי דם מהגולגולת. איבוד דם זה גרם ראשית לצניחת טמפרטורת הגוף של החיות. בעקבות הפגיעה במוח ובאופן ספציפי בגרעינים המוטוריים, משפגה השפעת חומר ההרדמה, החיות הראו פעילות מוטורית היפר-אקסיטבילית שהתבטאה בקפיצות פרועות, ריצה וכדומה. תגובה זו הביאה במקרים רבים לחידוש הדימומים התוך-גולגולתיים, זינוק של טמפ' הגוף ל C /4 ופרכוסים. כדי להפחית מהתנהגות זו החיות טופלו בואליום 1mg/kg( )diazepam ובנוסף ב phenytoin )אנטי-אפילפטי( במידה והטיפול הראשון לא הועיל. 66

כמחצית החיות מתו תוך שבוע בעקבות הפסקת נשימה; מהשורדים חצי שרדו כשלושה שבועות והיתר עד שלושה חודשים. סיבות אפשריות לאחוז התמותה הגבוה הן רבות אולם המשמעותיות הן: עקב ניתוק החיבור בין גזע המוח וההיפותלמוס לא הייתה להן יכולת לשמור על חום גוף קבוע,)poikilothermic( טמפרטורת גופן יכלה לצנוח ל 26-30 C )היפותרמיה( או להגיע 44 C-/4 בעקבות חימום יתר של הכלוב )היפרתרמיה(, דימומים חזקים, פרכוסים לא נשלטים, או פגיעה בגזע המוח בעת הניתוח. בנוסף איבוד מחזור ערות 0 שינה יום 0 לילה- החיות נצפו נעות בכלוב לאורך כל שעות היממה ותקופות השינה קצרות ומקוטעות. כמו כן פגיעה מהותית בקואורדינציה- חוסר יכולת להחזיק מזון לאורך זמן בגפיים ואף בפה, עד כדי כך שעל מנת לשמר אותן בחיים החיות הוזנו באוכל ושתייה 1-4 פעמים ביום ע"י צינורית לקיבה לאורך כל הניסוי ]184[. למרות ההזנה האינטנסיבית החיות איבדו בתוך חודש %/1 ממשקל גופן ]178[. יחד עם זאת רבע מכלל החיות המנותחות שרדו תקופה נוספת שנעה בין שבועות לשלושה חודשים. כאמור, היתרון בשימוש בשיטה זו הינו היכולת לבצע ניסויים ממושכים ללא צורך בחומרי הרדמה או אלחוש היות שהחיות לא חוות כאב וסבל, ואכן כל חיה שימשה לניסויים חוזרים ואף לניסויים שונים שהסתיימו במידה והחיה הגיעה לתת-משקל או מתה ]178[{. לסיכום, השימוש בניתוח הסרת המוח היה נפוץ מאוד בחקר תופעת ה WU בשנות ה-/ 8 וה-/ 2 )כפי שנמצא בסקירה ספרותית ב pubmed על פני עשורים(. ניתוח זה מלווה בטראומה משמעותית שמתבטאת במדדים פיסיולוגיים רבים ובאחוז תמותה גבוה. ניתן להניח כי למניפולציה כזו השפעה על מערכות רבות בגוף כולל מערכת העצבים שנותרה לאחר הניתוח. כיום ידוע לנו רבות על מעורבותה המרכזית של מערכת החיסון בהפעלת מנגנוני כאב ע"י שחרור מתווכי דלקת בעקבות נזק רקמתי. ניתן להעריך כי ההשפעה של מודל זה לדוגמה על פעילות תאי הגליה במערכת העצבים המרכזית הינה דרמתית וכרוך בהגברה אם לא באיתחול מנגנוני כאב. לסיכום, לשימוש במודל ה- decerebration יתרון ברור בכך שהוא חוסך את השימוש בחומרי הרדמה אולם הוא ככל הנראה השפעה מכרעת על אתחול ומהלך מנגנוני הכאב בחיה. יתר על כן מהסיבות הנזכרות לעיל ברור שבמודל של decerbration ההסתברות לזהות שינויים קלים יחסית, כדוגמת השינוי הבין סידרתי שמתואר בעבודה זו,)WoW( קטנה ביותר. ההשוואה בין שיטות העבודה במחקרי wind-up אחרים לבין מחקרנו העלתה הבדלים נוספים בהם מניפולציות ניתוחיות לפני תחילת שלב הגירויים כגון: 1( חתך בעור ובשרירים עבור פתיחת גישה אל העצב )בד"כ הסכיאטי(, ובמקרים אחרים 0( חיתוך של עצב כדי להניח אותו על האלקטרודה המגרה, או 1( ניתוחים עבור רישום התגובות שכללו חשיפת חוט השדרה וחיתוכו. בכל אחת מהמניפולציות הנ"ל )או בשילוב שלהן(, החיות הגיעו אל תחילת הניסוי 'לא נאיביות לגירויים מכאיבים', כלומר מגורות )conditioned/primed( כפי שהודגם בעבר ]185[. אי לכך, ככל הנראה, החיות החלו את הניסוי עם מערכת עצבים מגורה, מצב שמיסך על רמת התגובות הראשונית הנמוכה המתקבלת בסדרה הראשונה בחיה נאיבית. רמז להסבר זה קיבלנו בניסוי הרישום במקביל מהעצב הסכיאטי והשריר )סעיף 6.0.1, איור 17(. בניסוי זה חתך שביצענו כדי לפתוח גישה לעצב הסכיאטי הביא לריגוש מרכזי עוד בטרם סדרת הגירויים הראשונה; ריגוש שהתבטא כבר בתגובה לגירוי הראשון בצורת עקומת רוויה )אקספוננציאלית(. אישוש נוסף לטענה זו )סעיף 6.0.0, איור 12( הראה באופן ברור כי נרשמות תגובות חזקות )ב )EMG של הרפלקס הנוסיספטי במהלך החתך )איור 12 פאנל ימני( ואכן נרשמה תגובה מוגברת כבר לסדרת הגירויים הראשונה. בנוסף, בחלק מהמחקרים פרוטוקול העבודה בניסויי WU מתחיל בסדרות גירויים בתדירות נמוכה )שאינה יוצרת )WU על מנת להעריך את סף התגובה של סיבי ה- C ובדיקת תגובת הבסיס,(baseline) בכדי שבמהלך הניסוי יעשה שימוש בעצמת גירוי על-ספית )עצמת גירוי שנעה בתחום של פי 1.5-5 מעצמת הסף(. כלומר, פרוטוקול זה מחייב מתן מספר רב של גירויים נוסיספטיים בשדה הרצפטיבי לפני תחילת בדיקת תופעת ה- ]141, WU 186-126[. בחנו את השפעה אפשרית של 67

פרוטוקול מסוג זה בניסוי שבאיור 8 )סעיף 6.1.1(, השפעת תדירות הגירוי על יצירת ה-.WoW ניסוי זה מדמה פרוטוקול בדיקת סף לגירוי הנעשה בתדירות נמוכה שאינה יוצרת WU )איור 8 שמאל(, אולם מתן גירוי נוסף בתדירות בטווח ה WU מביא תגובות מוגברות.)WoW( כלומר שבמחקרים בהם בוצעו גירויים נוסיספטים מקדימים אפילו בתדירות נמוכה עבור איתור השדה הרצפטיבי, או גירויים עבור מציאת סף תגובה אישי, נוצרה בפועל רגישות מרכזית טרם תחילת הניסוי. חשוב לציין כי כל עוד עצמת הגירוי המקדים היא מתחת לסף הפעלת הנוסיספטורים לא תיווצר רגישות מרכזית, כפי שמצאנו בניסוי שתוצאותיו מתוארות באיור 10. מניסוי זה עולה כי גירויי ממושך בעוצמה שאינה מפעילה נוסיספטורים לא יוצרת WU ולא.WoW 1. מנגנון ה WoW הינו מרכזי: תכונה ידועה של תופעת ה WU היא משך זמן האפקט הקצר של סדרת גירוי. הנתון המקובל הוא שהפוטנציאציה הנוצרת לאחר WU נשמרת בין 1-5 דקות ]72, 127[. פוטנציאציה זו נמדדה בדרכים שונות: מספר פוטנציאלי הפעולה המקסימאליים שנמדדו במהלך סדרת הגירוי, פעילות ספונטנית בנוירונים המגורים מיד בסיום הגירוי )שניות(, או מדידת רפלקס בודד כתגובה לגירוי בודד הניתן אחת ל /1 שניות עד דעיכת הרפלקס ]188, 127[. 182, בהתאמה עם מחקרים אלו, מצאנו במחקרנו כי אכן מתקבלת תגובה זהה לגירוי הראשון בכל הסדרות, כלומר שגירוי בודד הניתן לאחר /1 דקות )מתום הסדרה הקודמת( לא מראה תגובה מוגברת )פוטנציאציה(. אולם במידה ובוחנים את הפוטנציאציה על פני סדרה שלמה ניתן להבחין בהגברת ה.WoW יתרה מכך ובניגוד למקובל בספרות זו, מצאנו כי תופעת ה WoW נוצרת דווקא בפרק הזמן שבין סדרות הגירויים ואינה נוצרת כתלות במספר הגירויים שבסדרות )איור 14(. את השאלה האם מנגנון ה WoW הינו פריפרי או מרכזי בחנו במספר גישות. היות שהתופעה נמדדת ברישום פעילות הרפלקס )שריר( ההגברה עשויה להתרחש בשריר עצמו )פריפריה( או להיות תוצאה של פעילות מרכזית, כלומר חוט השדרה והמוח. כדי לבדוק האם ההגברה מתרחשת בשריר, בחנו את הפעילות בשני אתרים פריפריאלים: 1- בשריר ה- medial,gastrocnemiuos 0- בסיבי עצבים פריפריים היורדים מחוט השדרה לעצבוב השריר. בשיטה זו הצלחנו להשוות את עוצמת האותות בתגובה סדרת גירויים בשני האתרים במקביל. לאחר שמצאנו התאמה גבוהה בין הפעילות בשריר לפעילות שנרשמה מהעצבים היורדים מחוט השדרה )איורים 16 15, ו- 17 (, הגענו למסקנה שהפעילות שאנו מודדים בשריר הינה תוצאה של פעילות המגיעה מחוט השדרה ולא פעילות שרירית עצמאית. תוצאה זו מתאימה לידוע בספרות לגבי WU כפי שנמצא ברישום מקביל בשריר ובנוירונים השדרתיים מסוג ]1/4[. WDR כלומר שתהליך ה WoW הנרשם )ב EMG מהשריר( במחקר זה הינו תוצר של פעילות מרכזית. בשלב הבא בדקנו מעורבות אזורים על-שדרתיים )גזע המוח והמוח( במהלך תופעת ה.WoW מצאנו כי שעה אחרי חיתוך חוט השדרה, התגובות לשלוש סדרות הגירויים הן בטווח ה- WU הבזאלי, כלומר שלא התרחשה הגברה.(WoW) חשוב לציין כי נוצר WU בפרפרטים אלו והוא בוטל לאחר פגיעה באזור הלומברי של חוט השדרה. ניתן להסיק מתוצאה זו כי סדרת התגובות הראשונה )הבזאלית( בכל ניסוי WoW הינה תוצר פעילות הנוירונים הלומברים בלבד. אולם הסדרות המוגברות ( nd 2 ו 3( rd הינן תוצר של הנוירונים הלומברים לאחר הגברה מאזורים על-שדרתיים. ידוע כי לחיתוך חוט השדרה השפעות שונות על תגובות רפלקס שדרתיות, התלויות במיקום ואופן הניתוק. לדוגמה: לאחר סילוק המוח )decerebration( ובהמשך חיתוך חוט השדרה )spinalization( מתקבלת הגברה בתגובות הרפלקס ]1/7, 158[. 157, לעומת זאת התקבלה הפחתה בתגובות במידה וחוט השדרה נחתך ללא מניפולציות קודמות ]72, 1/6[. אופן הניתוק שנערך בניסויים שלנו נעשה 68

ללא סילוק המוח )תוך הקפדה על מינימום פעולות ניתוחיות( והתגובות המופחתות שקיבלנו הינן בהתאמה עם מחקרים קודמים,72[.]1/6 ידועים מספר מנגנונים על-שדרתיים להגברה או דיכוי נוסיספציה בחוט השדרה. האותות היוצאים מחוט השדרה עולים thalamus, periaqueductal grey, parabrachial area, rostral אל מרכזים במוח ובגזע המוח: )ascending pathway(.ventromedial medulla בהמשך המידע מהתלמוס מתפזר בין אזורים רבים במוח המכונים matrix" "pain )כוללים:.]128[ )primary and secondary somatosensory, insular, anterior cingulate, and prefrontal cortices מסלולים יורדים מגזע המוח pathways( )descending עשויים להיות מגבירים או מדכאים פעילות נוסיספטית בחוט השדרה. תהליך זה הינו תוצר של שתי קבוצות תאים במערכת ה rostral ventromedial medulla ( PAG-RVM grey- )periaqueductal המכונים תאי ON )בעלי פעילות פרו-נוסיספטית( או תאי OFF )בעלי פעילות אנטי-נוסיספטית( ]122[. בחיה נאיבית )מורדמת( נשמר איזון בזמני הירי של שני סוגי התאים אולם במידה וניתן גירוי חום מכאיב, האיזון מופר וכך תאי ON יורים יותר ותאי OFF מושתקים ]122[. לחילופין, בעת טיפול אנלגטי תאי ה ON מושתקים ואילו תאי ה OFF יורים בצרורות ]//0[. השימוש בשיווי משקל זה בתנאים בזאליים מאפשר שינוי בסדר הקדימויות להתנהגות כאב על פני פעילויות שגרה אחרות. אכן, נמצא שינוי במאזן פעילות התאים המשמר כאב במודלים של דלקת ונזק עצבי ]0/1[. במדידות זמנים שנערכו מתאי ON ב RVM לאחר גירויי חום נוסיספטים, התאים החלו לירות רק 1 דקות לאחר הגירוי, הירי הגיע לשיא ב 6 דקות ונפסק לאחר 15-18 דקות מהגירוי ]0/0, 0/1[. יתכן וניתן להסיק מממצא זה כי בעת השימוש בפרוטוקול ה,WoW התגובות בסדרה הראשונה מתרחשות בזמן פעילות בזאלית של תאי ה.OFF-ON תאים אלו משנים את מאזן הירי לטובת תאי ה ON לאחר מספר דקות ולכן הסדרות הבאות מוגברות בהשוואה לסדרה הראשונה. תמיכה נוספת לכך ש WoW הינה תופעה מרכזית מקורה בצביעה חיובית של הסמן.pERK בתגובה לגירויים נוסיספטים עולה רמת perk תוך דקות בודדות ]57[ וגורמת לשרשרת תהליכים היוצרים רגישות מרכזית. אכן, בסדרת ניסויים מקדימים מצאנו עליה ב perk בחוט השדרה /1 דקות אחרי סדרת גירוי WU )איורים 4 ו 5 בפרק השיטות(. בקבוצת הביקורת )ללא גירוי( לא נמצא סימון perk )איור 4(. אולם בקבוצת הגירוי מצאנו עלייה מובהקת בסימון בשכבות השטחיות והעמוקות בדומה למקובל בספרות ]57, 0/4[. 58, בהמשך בחרנו בשני זני עכברי WT המגודלים במעבדתנו אשר אופיינו בעבר ונמצאו שונים ברגישותם הבזאלית למגע ולחום ]144[, וכן במדד האוטונומי וירי ספונטני לאחר נזק עצבי ]141[. זנים אלה הם בעלי תגובת בסיס שונה לגירויים נוסיספטים והם נבדלים במועדות 0 נטייה לפיתוח כאבים כרוניים במודלים שונים. כאשר נבדקה תגובת זנים אלו בפרוטוקול ה WoW נראתה התאמה למבחנים ההתנהגותיים והאלקטרופיסיולוגים הקודמים. כנינו אותם High WoW ו- Low WoW ע"פ רמת התגובות. הנתון שבלט בבדיקה זו בזן Low WoW הוא קיום הרפלקסים הנוסיספטים כמו גם יצירת WU בשלושת סדרות הגירוי אך ללא ההגברה הבין סדרתית )ללא.)WoW כאשר בדקנו רמת /1 perk דקות אחרי גירוי WU בזנים אלו, מצאנו פי 0.5 פחות סימון perk בחוט שדרה של זן ה Low WoW בהשוואה לזן ה-.High WoW לפיכך נראה כי יש צורך ברמה מסוימת של perk כדי שתיווצר הגברה בסדרה הבאה. פעילות perk היא מידית ועשויה להגביר תגובות wind-up בעקבות הגברה בכניסת יוני סידן לנוירונים. ידוע כי טיפול בחסם )0126-U( ERK מביא להפחתה בתגובות WU באופן תלוי מינון ]0/4[. היות שזני המחקר הנוכחי הינם זני ביקורת )WT( שאינם מאופיינים גנטית, הסיבה להבדלים באופיים הנוסיספטי אינה ידועה כעת והיא מצריכה ברור מנגנוני. על אף שהמנגנון המדויק אינו נהיר עדיין, ניסוי זה מספק עדות לקשר ברור בין יצירת WoW לבין רמת ERK מזורחן. המידע החדש שהתקבל מבדיקת ה- WoW בזנים אלה תואם את הידוע לנו מבדיקות קודמות אחרות. עובדה זו מציבה את מדידת ה- WoW כשיטה לזהויי נטייה לפיתוח רגישות מרכזית ואולי אף מועדות לפיתוח כאב כרוני. 62

+2 Ca הסידן בשלב הבא בדקנו מעורבות קולטני NMDA ב.WoW קולטנים אלו ממוקמים בעיקר במערכת העצבים המרכזית ותפקידם במסלולי כאב באופן כללי, ובפרט במנגנון יצירת ושימור ה,WU תוארו כבר בפרוטרוט ]21, 0/5-0/7[. מצאנו כי חסימת קולטני NMDA קודם לתחילת הגירויים מנעה את יצירת ה WU בסדרה הראשונה והפחיתה אך לא מנעה יצירת WU בסדרות הבאות. ה WU המובהק שנוצר בסדרות הבאות לא הגיע לרמה שונה סטטיסטית מהסדרה הראשונה ולכן לא נוצר.WoW תוצאה זו הינה בהתאמה לידוע בספרות לגבי מרכזיות קולטני NMDA במנגנון יצירת.WU בניסוי הבא שערכנו בדקנו האם קולטני ה NMDA חיוניים גם בשימור הפוטנציאציה )הגברה( לאחר שכבר נוצרה. בניסוי זה מצאנו כי /1 דקות אחרי הזרקת האנטגוניסט, רמת התגובות נשארה גבוהה, אולם /4 דקות אחרי ההזרקה רמת התגובות הופחתה לרמת הבסיס. גם תוצאה זו הינה בהתאמה לידוע בספרות לגבי חשיבות קולטנים אלו בשימור רגישות מרכזית ]21[. עלייה חדה ברמת התוך-תאי מעבר לסף מסוים היא ככל הנראה גורם המפתח שמחולל רגישות מרכזית. חדירת שטף סידן דרך קולטני ה NMDA היא הדרך החשובה ביותר לאתחול השלב המוקדם ]17[. בניסויים אלו ריכוז האנטגוניסט ( 1mg/kg )MK-801 הינו גבוה מאוד יחסית למקובל במחקרים אחרים ואנו מניחים כי בריכוז זה האנטגוניסט חסם את כל קולטני ה.NMDA לפיכך אנו משערים כי ה WU שנוצר בסדרות 2 nd ו- 3 rd הינו תוצר של מסלולים מקבילים שמביאים לעליית סידן תוך-תאי, דוגמת תעלות AMPA חדירות לסידן ]18, 12[, תעלות סידן תלויות מתח ]/4[, או שחרור ממאגרים תוך- תאיים בתגובה להפעלת חלבונים מטבוטרופיים ]41, 40[. התוצאות שהתקבלו במחקר זה מאששות ממצאים ממחקרים קודמים ומוסיפות תמיכה משמעותית לטענה שמנגנון ה WoW הינו מרכזי. 1. התנהגות כאב אחרי גירויי WU ו :WOW תופעת ה wind-up הינה תופעה אלקטרופיסיולוגית שההשפעה ההתנהגותית שלה לא נבחנה באופן שיטתי למיטב ידיעתנו. בסקירה ספרותית נרחבת שערכנו חפשנו מידע הקשור בהשפעה של גירוי נוסיספטי בתדירות נמוכה על התנהגות כאב. הסקירה נערכה במנוע החיפוש )http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed( Pubmed בשתי אסטרטגיות חיפוש: 1- בשימוש במילות החיפוש: stimulation, temporal summation, wind-up, pain behavior, nociceptive electrical low/high frequency stimulaion בשילובים שונים בכותרת ותקציר המאמר. 0- בדיקה נוספת נעשתה ע"פ שמות המחברים הידועים ביותר בתחום ה Herrero, J. F, Wall, P. D, McMahon, S. B Woolf, C. J, Cervero, F, ( WU.)You, H. J, Arendt-Nielsen, L, Li, J, Gozariu, M, Le Bars, D בחיפוש זה מצאנו מחקרים רבים הבוחנים שינויים במדדי כאב בחיות בעקבות גירויים חשמליים. חשוב לציין כי לסדרת WU קיימים שני היבטים: 1- כסדרת גירויים נוסיספטים, ו 0- כסדרת תגובות המשקפת רמת עוררות נוירונאלית. בדיקה של המאמרים שעלו בחיפוש מראה כי כאשר החוקרים בדקו השפעות של סדרת גירויי WU נערכה בדרך כלל מדידה של תגובות פיסיולוגיות )בעיקר רפלקס נוסיספטי או פעילות עצבית בחוט שדרה( ולא מדידה של התנהגות כאב. במחקרים בהם סדרת ה WU הינה מדד לרמת הרגישות המרכזית, ה WU נמדד לפני ואחרי טיפולים שונים מבלי לכלול את השפעת גירוי ה- WU על המבחן. יחד עם זאת, למרות החיפוש שערכנו, אנו ערים לכך כי יתכנו מחקרים אשר בחנו השפעת גירוי WU על התנהגות כאב שלא נמצאו עכב שימוש במילות חיפוש שונות או מחברים אחרים שלא בדקנו. בניסויים שערכנו, מצאנו כי חיות אשר גורו בסדרת גירוי אחת )WU( פיתחו רגישות מוגברת למגע למשך 24 שעות לפחות, ורגישות לחום למשך 48 שעות לפחות. להפתעתנו מצאנו כי אין הבדל בין התנהגות הכאב לאחר סדרה אחת של גירוי לבין זו שנרשמה בקבוצות שקיבלו 2 או 3 סדרות )איור 07(. בכל הקבוצות נרשמה התנהגות כאב מוגברת דומה. יתכן כי ניתן 7/

להסיק מניסוי זה כי התהליך העיקרי מבחינת יצירת הריגוש המרכזי מתרחש במהלך ובעקבות הסדרה הראשונה, וכי הסדרות הבאות משקפות את ההשפעה של הגירוי הראשון אך לא מגבירות את האפקט של תחושת הכאב. העדר בדיקה דומה בספרות ככל הנראה משקף את הדעה הרווחת לגבי השפעתו קצרת הטווח של מודל 0 גירוי ה.WU במחקר יחיד שמצאנו )]/11[ )ref נבדקה השפעת גירוי חשמלי בתדירות יחסית נמוכה על התנהגות כאב החיות. הגירוי ניתן בתדירות 10Hz )מעבר לטווח ה )WU למשך 5 דקות, מספר פעמים בעוצמות ורוחב פולס משתנים 150-500 μs,5--10ma ישירות לעצב הסכיאטי. במחקר המתואר, החיות הראו רגישות למגע למשך 48 שעות. מעניין לציין כי יצירת ריגוש מרכזי בחיות בעקבות פרדיגמת גירוי ארוכת-טווח HFS(,)high frequency stimulation, היוצרת LTP במסלולים הנוסיספטים, נבחנה במספר מחקרים ]/0/8-01[. במחקרים אלו נמצא כי גירוי חשמלי נוסיפטי בתדירות גבוהה ( of 0.5ms, 100Hz,,30-40V 10 trains )2sec הביא לרגישות לחום ומגע למשך 6-8 ימים. הגירויים בניסויים אלו ניתנו לעצב סכיאטי שלם )כלומר מכל השדות הרצפטביים שלו( וחשוף )גירוי מהחתך והדלקת בנוסף לגירוי החשמלי( דבר שבוודאי הגביר את עוצמת הגירוי; זאת בהשוואה לניסוי שלנו שבו הגירוי ניתן באופן נקודתי בעור כף הרגל )שדה רצפטיבי קטן יחסית( וללא ניתוח. במחקר אחר, בדיקות התנהגותיות בחיות ערות לאחר גירויי HFS הראו רגישות גבוהה לחום במבחן hot-plate ברגל המגורה וגם ברגל הקונטרא-לטרלית ]86[. מדידות פיזור משקל ותגובה לגירוי חום הראו כי לעומת קבוצת ביקורת, החיות המגורות מפחיתות משקל באופן משמעותי מהרגל המגורה ורגישות לחום למשך 48 שעות ]86[. ניסויים אלו מראים כי קיימת התאמה בין מודל הגירוי החשמלי הגורם ל- LTP להתנהגות כאב בחיות ערות. בנוסף קיימים מספר ניסויים שבחנו בבני אדם את ההשפעה של גירויים חשמליים בתדירות גבוהה,HFS( 5 x 1 sec at 100 Hz פרוטוקול מקובל ליצירת )LTP לעומת נמוכה,LFS( 17 min at 1 Hz פרוטוקול מקובל ליצירת.)LTD במחקרים אלו הנבדקים דיווחו כי גירוי HFS גרם לתחושת כאב למשך 1 שעות LTP( לכאב( ואילו גירוי ה LFS גרם לדיכוי כאב למשך כשעה LTD( לכאב( ]/7[. נתונים אלו תומכים ב LTP כמנגנון אפשרי לרגישות מרכזית וכאב כרוני. לעומת זאת פרוטוקול ה LFS אמנם בטווח התדירות של WU אולם הגירוי נמשך 17 דקות רצוף ולכן גורם ל LTD ולא להגברה בפוטנציאציה. הקשר בין גירוי חשמלי וגירוי WU לבין תחושת כאב נבדק בבני אדם. מדידת הרפלקס הנוסיספטי )ע"י גירוי חשמלי בודד( הינה כלי מקובל עבור מחקר ודיאגנוסטיקה בקליניקה ]011, 010[. במחקרים בבני אדם הטרמינולוגיה המקבילה ל wind-up )בחיות( הינה סכימה בזמן- temporal summation )אולם לצורך שמירה על עקביות ובהירות המינוח- השימוש במונח WU יישמר(. במחקרים כאלו נמצא מתאם גבוה בין עוצמת הרפלקס הנמדד לבין הדיווח על רמת תחושת הכאב ]011[. כמו כן נבחנה ההשפעה של מדדי הגירוי )תדירות ועוצמת גירוי( על עוצמת הרפלקס בהתייחס תחושת הכאב מיד בסוף סדרת הגירוי ]014[ או במהלך הסדרה ]015[. במחקרים אלו לא נמדדה משך תחושת הכאב מסיום הגירוי ולא נעשתה השוואה בתחושת הגירוי סדרה אחרי סדרה. במחקרים אחרים נמצא כי במהלך סדרת הגירוי גדל השדה הרצפטיבי באזור הגירוי ]28[, אולם תחושת הכאב שבה לרמת הבסיס כ /1 שניות מתום הגירוי )ללא גירוי נוסף( ]016[. כמו כן נמצא כי חסימת קולטני NMDA היא בעלת אפקט דומה לתוצאות בבעלי חיים ]017-012[. השימוש ב WU הראה במספר מחקרים הבדל משמעותי ברמת התגובות לסדרת WU בחולי פיברומיאלגיה לעומת בריאים ]018, 001-/00[. לסיכום, ההשפעה של גירוי WU על התנהגות כאב בחיות נבדקה, למיטב ידיעתנו, בפעם הראשונה במחקר זה. שימוש בגירוי העצב בתדירות גבוהה בעוצמה חזקה הביאה להתנהגות כאב דומה. ניסויים בבני אדם הראו מתאם גבוה בין תגובות הרפלקס לתחושת הכאב אך לא בחנו את השפעת הגירוי לאורך זמן ועל גירויים נוספים,למיטב ידיעתנו. 71

Ca +2 4. השפעת חסימת קולטני NMDA על התנהגות כאב. במחקר הנוכחי, בבדיקה שנערכה 7 שעות לאחר גירוי ה- WU נמצאה רגישות מוגברת למגע ולחום. חסימה מקדימה של קולטני NMDA מנעה אלודיניה למגע אך לא את הרגישות לחום בנקודת זמן זו )איור 02(. לאחר ארבעה ימים קבוצות חזרו לערכי הבסיס. עולה השאלה מדוע חסימת קולטני NMDA מנעה אלודיניה לגירויים מכאניים אך לא השפיעה על אלודיניה לחום? הסיבה המדויקת לכך לא מובנת לנו לעת עתה. ידוע כי קולטנים אלו קריטיים ביצירת ושימור רגישות מרכזית ]21, 004[. כמו כן כי טיפול בחסמי NMDA מונע בחלק מהמודלים רגישות לחום ]0/5, 005-008[ ובחלק מהמודלים רגישות למגע ]0/7, 008-011[. ככל הנראה המנגנונים ליצירת הרגישות לאופנויות )modality( השונות- חום ומגע הינם שונים ]010[. הסבר אפשרי לחוסר הפעילות של MK-801 על הרגישות לחום במחקר זה הינו פעילות המוגבלת לטווח טמפרטורות מסויים. במחקר בו טיפול מקדים בקפסאיצין גרם רגישות לחום, שימוש ב MK-801 הביא להקלה בכאב בעת גירוי חום בטמפ' של 38 c. אולם בעת גירוי בטמפ' 42 c לאנטגוניסט לא הייתה השפעה ]011[. בנוסף, לחסם לא הייתה השפעה על כאב בעת גירוי 50 c גם במצב נורמלי )ללא טיפול מקדים עם קפסאיצין( ]011[. באותו מחקר הועלתה השערה גם בדבר חלון זמן הפעילות של.MK-801 מבחינה זו יתכן כי במחקר הנוכחי, הגירוי התרמי )7 שעות לאחר הזרקת החסם ומתן הגירוי החשמלי( ניתן בזמן שרמתו של החסם ירדה מתחת לריכוז המספיק לחסימת התגובה לגירוי החום המכאיב שניתן במדידה. במחקר אחר נמצא כי חסמים שונים של תת החידה NR2B של קולטני NMDA מנעו אלודיניה באופן ספציפי למגע אך לא לחום ]014[. ממצא זה פותח אפשרות לטיפול ברגישות מאופנות אחת ללא פגיעה בתחושות אחרות ע"י חסימת תת יחידה מסויימת בקולטן. ניתן אולי להסיק מכך כי למודלי כאב שונים קיימת פעילות טיפוסית מיוחדת של תתי היחידות השונות שמהווים רקע להרכב התחושתי השונה בין כל מודל. 5. פרוטוקול ה WoW כחלופה לפרוטוקול LTP שמבוסס על :HFS השלב האחרון בניסוי שתואר בסעיף 6.1 הינו בחינת תגובות 7 WoW ימים לאחר גירוי.WU תגובת ה WoW התקינה שהתקבלה בשלב זה בקבוצת ה sham מראה כי גירוי הדקירה ע"י אלקטרודות הגירוי לא יוצר רגישות כלל. אולם, התגובות המוגברות בקבוצת Saline-Windup מלמדות כי המידע הנוסיספטי עשוי להישמר זמן רב )בדומה לריגוש ארוך טווח( לאחר סדרת גירוי WU בודדת. יחד עם זאת הרגישות לגירויים טבעיים, מגע וחום, חזרה לרמת הבסיס בכל הקבוצות כבר ביום הרביעי לניסוי )איור /1(, אם כי לא בדקנו רגישות בימים הבאים. עובדה זו מצביעה כי הגירוי החשמלי יוצר רגישות לאופנויות שונות מהגירוי )מגע וחום( לפרק זמן מסוים )עד 1 ימים( ואילו רגישות ספציפית ארוכת טווח לסוג הגירוי המכונן )גירוי חשמלי(. לעומת זאת, שימוש מקדים )preemptive( באנטגוניסט לקולטני NMDA שמנע את התפתחות הריגוש המרכזי בחוט השדרה הביא לדיכוי ארוך טווח )LTD( בתגובות לגירוי חשמלי חוזר 7 ימים אחרי. תגובה זו התרחשה עכב חסימת קולטני NMDA וככל הנראה ע"י כך חסימה של זרימת יוני בעת הגירוי. תוצאה זו הינה ייחודית מבחינת פרוטוקול ייצור ה 'LTD והיא מראה כי בדיקת ה WoW יכולה לזהות מצב של דיכוי נוסיספטי. התוצאות החדשניות של ניסוי זה מצביעות על יצירת זיכרון ספציפי לגירוי המכונן שהוא ארוך טווח הרבה מעבר למה שמצופה ממשך האפקט של גירוי.WU לדעתנו תוצאה זו התקבלה בזכות השימוש בפרוטוקול ה WoW כשיטת המדידה של אפקט ה WU במקום השיטה המקובלת ע"י גירוי נוסיספטי בודד. זיכרון ארוך טווח במסלולי הכאב מיוחס באופן קלאסי לגירוי בתדירות גבוהה )HFS( הגורם לתופעת ה,LTP ומקובל לראות בו הסבר לתהליך בו כאב אקוטי מתקבע והופך לכרוני. אולם קיימים מספר קשיים בשימוש במודל זה בחקר יצירת רגישות מרכזית. כפי שעולה מהספרות המחקרית, על מנת ליצור LTP במסלולים נוסיספטיים יש בדרך כלל צורך לבצע חיתוך בחוט השדרה ככל הנראה עקב מסלולים אנהיביטוריים היורדים מהמוח. לדוגמה, גירוי HFS בעוצמה של Aδ בחיה מורדמת עם חוט שדרה שלם גורם ל.LTD ואילו אותו גירוי בחיה עם חוט שדרה חתוך גורם ל ]75[. LTP לעומת זאת, 70

גירוי HFS בעוצמה המפעילה סיבי C יוצר LTP בחוט שדרה שלם אולם אך ורק בתאים בלמינה ה I המבטאים את קולטן ה- NK1 )ל )Substance-P ושולחים אותות )projection( לאזור ה- ]17[. parabrachial area קבוצת תאים מיוחדת החשובה בתהליכי עיבוד נוסיספטי. נמצא כי חיסול ממוקד של התאים המבטאים את קולטן ה NK1 ע"י טוקסין )סאפורין המצומד לליגנד )substance-p הפחית מאוד את התגובה לגירויים חזקים באופן נורמלי וגם אחרי דלקת ופגיעה עצבית ]015, 016[. כל שאר התאים בלמינה I, כלומר תאים המבטאים את קולטן ה NK1 ששולחים את האותות שלהם ל,periaqueductal grey או שאר התאים שלא ידוע אזור החיבור שלהם לא יוצרים LTP בתגובה לגירוי זה ]17[. נוסף על כך, אפילו גירויים טבעיים מזיקים וחזקים )כגון: חום, לחץ על העור, פורמלין תת-עורי, ופגיעה עצבית( לא מתבטאים ב LTP בחיה עם חוט שדרה שלם אך כן לאחר חתוך )וזאת בקבוצת תאים בלמינה ה )II ]77[. למרבה ההפתעה, בחוט שדרה שלם רק גירוי LFS יכול לגרום ל LTP בתאים ששולחים אותות ל.periaqueductal grey בתאים אלו גם גירויים טבעיים כמו דלקת יצרו LTP בחוט שדרה שלם. לאור זאת לדעתנו, מודל ה LTP )מגירוי )HFS בלמינות החיצוניות מאבד מהאטרקטיביות שלו כהסבר מנגנוני לרגישות מרכזית, הן משום שהוא מבוסס על תת-קבוצה קטנה של תאים בלמינה ה I, והן משום שאינו מתרחש בחוט שדרה שלם. יתרה מכך, במקרים שבהם נבחן מודל זה בחוט שדרה שלם, אופן הגירוי המתאים הינו LFS ולא התדירות הגבוהה הקלאסית. מודל ה LTP השני שנוסה בחוט השדרה נמדד בתאי ה.WDR במודל זה גירוי קצר בתדירות גבוהה )100Hz( ייצר LTP בתאי WDR למשך 6 שעות, חסימת קולטני AMPA ו- NMDA מנעו יצירתו, וגם לאחר שנוצר חסימת NMDA ביטלה את הפוטנציאציה ]/8[. גם במודל זה נמצאה מעורבות אזורים על-שדרתיים. מודל זה דומה במידה רבה למודל ה WoW עכב העובדה שתאי ה WDR מהווים את מנגנון הפעולה. אולם תדירות גירוי גבוהה כזו אינה תדירות הירי הפיסיולוגית האופיינית לסיבי C בעת דלקת או טראומה אחרת. תדירות הירי המקובלת לסיבים אלו בדלקת היא בסביבות ]87-82[, 1-10Hz לאחר טיפול עם הציטוקין IL-1β נמדדה תדירות ירי בטווח שבין ]/2[, 1-6Hz או לאחר נזק נוירופתי ]21[. 0.5-4Hz עובדה זו מעלה סימן שאלה לגבי התקפות של השימוש בגירויים בתדירות 100Hz לחקר רגישות מרכזית בתנאים פיסיולוגים. בניגוד לשני מודלי ה LTP שהוצגו, שיטת ה WoW עשויה להוות אלטרנטיבה פיסיולוגית למחקר רגישות מרכזית. ראשית, הגירוי בתהליך זה מדמה את טווח תדירות הירי המתאים לסיבי ה C בעת גירויים נוסיספטים טיבעיים. בנוסף, כפי שמצאנו, תהליך זה מתקיים אך ורק בחוט שדרה שלם. לבסוף, הניסוי הנידון מראה גם שימור מידע נוסיספטי לאורך זמן וגם ספציפיות לגירוי המכונן שכן הרגישות לגירויי מגע וחום נמשכה עד שלושה ימים ואילו התגובה המוגברת לגירוי החשמלי נשמרה לפחות שבוע. יש לציין כי פשטות שיטה זו בניגוד למקובל בניסויי LTP מאפשרת בדיקה התנהגותית לאחר הגירוי. כמו כן, בדיקת ה WoW רגישה לזיהוי גירויי כאב טיבעיים קודמים ועל כך בהמשך. לבסוף, תופעת ה LTP )ע"י גירוי )100Hz HFS תוארה לראשונה בהיפוקמפוס ובהמשך באזורים מוחיים נוספים. תופעה זו שמשה עד היום את המודל הקלאסי להיווצרות זיכרון במוח. התופעה עברה 'אימוץ' לעצבים הסנסורים המגיעים אל חוט השדרה ]68, 62[, והיא מחזקת את הרעיון שיצירת LTP במסלולי כאב עשויה להוות מנגנון עבור 'זיכרון לכאב'. ההנחה הכללית הינה ששינויים ארוכי טווח LTP ו- LTD נוצרים ע"י דפוסי פעילות בעלי תדירות גבוהה ונמוכה, בהתאמה. אולם בשנים האחרונות דוגמה זו עוברת שינוי עקב עדויות חדשות ממחקר תהליכי זיכרון בהיפוקמפוס ]017[. המנגנונים לתהליך זה נחלקים לשניים על פי סוג הפרפרט. בתאי CA1 בפרוסות היפוקמפוס נמצא כי גירוי 1Hz גרם לתהליך התלוי בקולטנים מטאבוטרופיים של גלוטמאט mglu5 אך לא תלוי בקולטני ]018[. NMDA אולם in-vivo בחיה מורדמת ביורתן נמצא כי בתאי CA1 נוצר LTP בגירוי 1Hz וכי מנגנון זה תלוי בקולטני ]012, NMDA /04[. מסתבר כי גירוי בתדירות 100Hz אינו מאפיין את דפוס הפעילות העצבית הפיסיולוגית בהיפוקמפוס ]017[. לדוגמה תדירות תטא )3-12Hz( מתרחשת בסוגי 71

התנהגות שונים )הליכה, שינויי תנוחה, תנועות ראש ועוד(. בעת התנהגויות אחרות כמו גרומינג, חוסר תנועה וליקוק נמדדה תדירות פעילות הנעה בין.0.02-3Hz במהלך שינה או בעת הרדמה נמדד דפוס תדירות באזור ה.1Hz אי לכך, שימוש בתדירות נמוכה ליצירת LTP בהיפוקמפוס קרוב יותר מבחינה פיסיולוגית לדפוס הפעילות העיקרי שבו ]017[. לדברי החוקרים, ממצאים אלו קוראים תיגר על דוגמת HFS-LTP ו- LFS-LTD ומראים כי פלסטיות סינפטית ארוכת טווח עשויה להתקבל בדרכים שונות מהמקובל. האם ניתן להרחיב מסקנה זו גם לשינויים ארוכי טווח במסלולים נוסיספטים? על שאלה זו אין לנו תשובה כעת ויידרשו מחקרים נוספים כדי לענות עליה. 3. מעורבות מיקרוגליה ב :WOW במחקר זה, טיפול מקדים )שלוש הזרקות במהלך ה 04 שעות שלפני הגירוי( הביא להפחתה משמעותית בתגובות ה windup ולהבדל משמעותי מקבוצת הביקורת. תוצאה זו הינה בהתאמה עם מחקרים אחרים שהראו כי מינוציקלין מפחית אלודיניה והיפראלגסיה. ככל הנראה, מנגנון הפעילות האנטי-נוסיספטית של מינוציקלין מבוסס על עיכוב מסלולי )MAPK( mitogen-activated protein kinases ו- ]041[, NfkB במיקרוגליה ובעקבות כך הפחתה בייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים ]040-046[. יחד עם זאת קיימות מספר עדויות להשפעה של מינוציקלין ישירות על הנוירונים והסינפסות אך המנגנון לכך אינו ברור עדיין במלואו. כפי שנמצא במחקר זה בהתאמה עם מחקרים קודמים, מנגנון ההגברה העיקרי של תופעת ה WU )וה- )WoW הינו הפעלת קולטני NMDA ע"י גלוטמט. לאור האפקט המרשים של מינוציקלין על הנחתת תגובות ה WU במחקר הנוכחי, ניתן לשער כי מינוציקלין משפיע ישירות על קולטני AMPA ו- NMDA או על זמינות רמת הגלוטמט. ידוע כי רמת הגלוטמט החוץ-תאית הינה קריטית מבחינת העוררות הסינפטית,אולם רמה גבוהה מידי עשויה להיות נוירו-טוקסית. כדי למנוע רמה גבוהה של גלוטמאט בסינפסות קיימים טרנספורטרים של גלוטמט GLT1( )GLAST, על אסטרוציטים המפנים את הנוירוטרנמיטר מהסינפסות ושומרים בכך על הומיאוסטסיס. נמצא כי בעקבות נזק נוירופתי, נפגע ביטוי טרנספורטרים אלו, ואילו טיפול מקדים במינוציקלין שמר על רמתם באסטרוציטים ]047[. בנוסף רמת העוררות האסטרוציטית הכללית הופחתה כפי שנמדד ע"י סימן ביטוי ]047[. GFAP אם כך, טיפול במינוציקלין עשוי לשמור על רמת טרנספורטרים גבוהה וכך להשפיע על רמת גלוטמט תקינה ולגרום להפחתה באלודיניה לחום ומגע ]047[. במודל אחר, הזרקת היסטמין ישירות לחוט שדרה גרמה להתנהגות נוסיספטית ולזירחון של קולטן ה NMDA )בתת-היחידה ;)NR1 הוספה של מינוציקלין הפחיתה משמעותית את זירחון הקולטן ובכך ככל הנראה הפחיתה מהתנהגות הכאב ]048[. התוצאות של המחקר הנוכחי הינן בהתאמה עם העדויות שתוארו כי טיפול מקדים במינוציקלין עשוי להפחית תהליכים נוסיספטים. לאור הממצאים של המחקרים שנסקרו לעיל, ייתכן שההפחתה הדרסטית שנמדדה ב- WoW עשויה לנבוע מפעילות של מינוציקלין על הפחתת זירחון קולטני NMDA או ע"י שמירה על רמה תקינה של טרנספורטרים לגלוטמט. 1. מעורבות IL-1 ב מנגנון הגברת ה :WoW מחקרים קודמים במעבדותינו הראו השפעה של חסימת IL-1 על רגישות בזאלית לחום ולמגע ]144[. בנוסף, לחסימת הציטוקין IL-1 הייתה השפעה אנלגטית במודלי כאב שונים ]141, 042[. ידוע כי הזרקה של IL-1 )אקסוגני( מגבירה ]112-140[. WU במחקר הנוכחי בדקנו האם IL-1 אנדוגני משתתף בתהליך ה- WoW ובתוך כך גם בתהליך ה.WU כדי לבדוק זאת, לפני סדרות הגירוי, חסמנו באופן סיסטמי את מערכת IL-1 בעזרת האנטגוניסט האנדוגני.IL-1ra מצאנו כי חסימה מקדימה של הציטוקין IL-1 )באמצעות )IL-1ra לא שינתה את דפוס ה.WoW אנו סבורים כי ככל הנראה המרווח הבין סדרתי )/1 דקות( אינו מספיק עבור ייצור, שחרור וקליטת IL-1 עד שיהווה מנגנון הגברה עבור הסדרה ה במנגנון הגברה של.WoW וה 3. rd עם זאת, בהחלט יתכן כי ציטוקינים אחרים כדוגמת TNFα משתתפים 74 2 nd

1. השפעת גירויים מקדימים על :WOW מצאנו כי מספר גירויים שניתנו לפני בדיקת,WoW כמו חתך עמוק בירך, גירוי תרמי חזק, וגירוי חשמלי,)WU( גורמים לתגובת מוגברת כבר בסדרה הראשונה. לעומת זאת שימוש במודל חתך בכף הרגל כגירוי מקדים לא שינה את דפוס ה- WoW. הדיון במודל אחרון זה, שבו בדיקת ה WoW לא השתנתה, מבהיר את מגבלות השימוש במודל ה- WoW ככלי אבחון, ומאידך מבליט את התועלת האפשרית שגנוזה בו. מודל חתך כף הרגל model( )postoperative pain פותח על מנת להבין כאב אקוטי המתפתח באזור החתך הניתוחי. מחקרים שהשתמשו במודל זה מראים כי הרגישות המוגברת לגירויי מגע וחום באזור החתך מתחילה מיד לאחריו )עם התעוררות החיות מההרדמה( ונמשכת כשבוע. החוקרים רשמו ירידה בסף ההפעלה של כלל הסיבים הפריפריים ]/05[, ופעילות ספונטנית בסיבי C ]051[, ממצאים שהצביעו על קיום רגישות פריפרית. כמו כן התגלתה היפראלגסיה ראשונית ומשנית דבר שמרמז על רגישות מרכזית ]154[. מחקר נוסף עם מודל זה הראה פעילות תאים ספונטנית בקרן הדורסלית, אם כי מופחתת יחסית לנצפה במודלי כאב ארוכי טווח ]050[. אלחוש מקומי )Bupivacaine( טרם הניתוח מנע רגישות למשך 4 שעות; הזרקות של bupivacaine אחרי הניתוח גרמו לאפקט דומה. בנוסף, האלחוש הפריפרי חסם את פעילות הנוירונים בקרן הדורסלית בעת הניתוח ומנע את הגדלת השדה רצפטיבי לדקירה לאחר מכן. גם טיפולים שנערכו /2 דקות אחרי החתך מנעו רגישות שכבר נוצרה, אולם כשאפקט החומר הסתיים רגישות זו שבה ]051[. מכאן שאין צורך בפעילות הנוירונים השדרתיים על מנת ליצור רגישות במודל זה, מיד לאחר הניתוח. בדיקת המעורבות של קולטני גלוטמט בחוט השדרה במודל של חתך ניתוחי העלתה תוצאה מפתיעה. טיפול בחסם של קולטן )NBQX( AMPA מנע לחלוטין את הפעילות הספונטנית של תאי עצב בקרן הדורסלית וגם את שימורה לאחר שכבר נוצרה. אולם לחסימת קולטן ה NMDA )ע"י MK-801 או )AP5 לא הייתה כל השפעה, במינונים ודרכי הזרקה שונים ]-054 058[. תוצאות תואמות התקבלו גם לגבי התנהגות החיות. מחקרים אחרונים עם מודל זה חושפים נקודה חשובה לגבי עומק החתך; החוקרים מצאו כי קיים הבדל משמעותי בתגובות הנוסיספטורים כאשר החתך נעשה בעור ובפאציה בלבד, לעומת חתך בעור ופאציה וגם בשריר הפלנטרי. התגובות הספונטניות מהסיבים לחתך העמוק, היו באחוז גבוה יותר וכן תדירות הירי הייתה גבוהה משמעותית ]151, 155[. מעניין לציין כי לא נמצא הבדל בהתנהגות הכאב של שתי קבוצות החיות. לאור המידע הקוהרנטי הרב שהצטבר ממודל זה, ניתן להבין מדוע במחקרנו, מודל החתך לא השפיע על דפוס ה.WoW קיימות ככל הנראה שתי סיבות מנגנוניות המבחינות בין מודל החתך לבין WU )ו- WoW (. 1- מודל החתך מבוסס בעיקר על פעילות פריפרית בעוד שמנגנון ה- WU מבוסס על פעילות תאי WDR שדרתיים. 0- הקולטן היחיד הפעיל בעקבות החתך בעור הינו,AMPA ואילו קולטן ה NMDA )הקריטי ליצירת ושימור )WU לא נמצא מעורב במודל זה. בנוסף חשוב לציין כי מודל החתך המבוצע במעבדתנו אומץ מחולדות לעכברים והוא כולל את חיתוך העור והפרדת רקמת החיבור כפי שתואר במודל הקלאסי אך אינו כולל את שלב חיתוך השריר שנוסף בעת האחרונה. לפיכך, אין בשינויים הצפויים בגירוי מקדים כזה כדי להשפיע ולשנות את תבנית ה- WoW. מן הלאו ניתן ללמוד על ההן - ניתן לומר כי בדיקת ה.NMDA עשויה לזהות רגישות מרכזית המערבת פעילות קולטני WoW 9. הצעת מודל המבוסס על בדיקת WoW ככלי למדד של רמת רגישות מרכזית: במחקרנו מצאנו מספר סוגי גירויים מקדימים אשר שינו את תבנית ה- WoW לעומת חיות נאיביות. על בסיס שינויים אלה ריכזנו ויצרנו שלוש קבוצות מייצגות: 75

AUC (ms X ma) AUC (ms X ma) AUC (ms X ma) 1- WoW תקין המורכב מממוצע כל קבוצות הביקורת )"קבוצה נורמלית"(. קבוצה זו מורכבת מכל הניסויים שלא נעשתה בהם כל מניפולציה קודם לגירוי. 0- WoW מוגבר המורכב מממוצע קבוצות הניסוי שקיבלו גירוי מכאיב קודם )"קבוצה מרוגשת"(. קבוצה זו מורכבת מניסויי בדיקת -WoW משני זנים שנבדקו אחרי גירוי חום, גירוי WU שבוע לפני בדיקת ה- WoW, ניסוי חתך בעור ושריר הירך. 1- WoW מדוכא המורכב מממוצע קבוצות הניסוי שקיבלו טיפול מפחית ריגוש )"קבוצה מאולחשת"(. קבוצה זו מורכבת מניסויי בדיקת -WoW אחרי טיפול אקוטי בחסם,NMDA טיפול במינוציקלין, טיפול בחסם NMDA שבוע לפני בדיקת ה-.WoW 8 7 6 5 4 3 2 1 1st 2nd 3rd WoW pattern in control animals # * * 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus N=52 animals 8 7 6 5 4 3 2 1 WoW pattern in conditioned animals 1st 2nd 3rd 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus N=35 animals 8 7 6 5 4 3 2 1 WoW pattern following inhibition 1st 2nd 3rd # * 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Stimulus N=23 animals איור 33: שימוש ב- WoW לבדיקת רגישות מרכזית. התגובות במחקר זה חולקו לשלוש קבוצות. גרף שמאלי הינו מיצוע של ניסויי ביקורת והוא מייצג את תבנית ה- WoW שמתקבלת באופן נורמלי )ללא טיפולים נוסיספטים או מאלחשים(. גרף אמצעי הינו מיצוע מכלל החיות שקיבלו גירוי נוסיספטי מקדים והוא מייצג את תבנית ה- WoW בחיה שהתפתחה בה רגישות מרכזית. גרף ימני הינו מיצוע של כלל החיות שעברו טיפול מאלחש. #, מייצג אפקט עיקרי של גורם 'סדרה', כלומר שנוצר.WoW *, מייצג הבדל מובהק בהשוואה לסדרה הראשונה. שלושת דפוסי ה- WoW המוצגים באיור 18 עשויים להבהיר את פוטנציאל השימוש ב- WoW ככלי דיאגנוסטי לבדיקת רגישות מרכזית. אלגוריתם שיבחין האם התגובות המתקבלות מחיה מסוימת מתאימות לקבוצה 'נורמלית', 'מרוגשת' או 'מאולחשת', עשוי להועיל באבחון מצב של כאב עם מאפיין של רגישות מרכזית. בחינת הגרפים בשלוש הקבוצות מראה דמיון בתגובה לגירוי הראשון בכל סדרה. לפיכך בדיקת תגובה לגירוי בודד לא תועיל משום שאינה מבחינה בין הקבוצות. יחד עם זאת, כיוון שהתגובה הראשונה שומרת על יציבות לאורך הסדרות בקבוצות השונות, ניתן להשתמש בה כבסיס למידת ההגברה. בנוסף, נשתמש בהשוואה הסטטיסטית בין עקומות התגובה כלומר, קיום או אי קיום.WoW בעזרת שני מדדים אלו הרכבנו אלגוריתם פשוט המאפשר הבחנה בין הקבוצות. פרמטרים נוספים שטרם בחנו עבור שיפור אלגוריתם זה עשויים לכלול: 1- יחס התגובה של הגירוי הראשון לעומת האחרון רק בסדרה הראשונה, 0- השוואת שיפוע הסדרה הראשונה, 1- השוואת האינטראקציה הסטטיסטית לסדרות. 76

איור 33: אלגוריתם לאבחנת רמת רגישות מרכזית בעזרת.WoW משמאל: תרשים זרימה עבור הערכת רמת הרגישות המרכזית. מימין: הסבר בגוף הגרף לאופן הניתוח. בשלב הראשון )מסגרת עליונה( נבדק קיום,WoW בשלב השני )מסגרת תחתונה( נבדק היחס שבין ממוצע התגובה ההתחלתית לממוצע 01 התגובות האחרונות בסדרות 2 ו- 3. שיטת הבדיקה: לאחר קבלת תוצאות התגובות מבדיקת ה,WoW בשלב הראשון ייבדק קיום או אי קיום.WoW כלומר האם 2 nd הסדרות ה וה- 3 rd שונות משמעותית מהסדרה ה- 1. st במידה ויש WoW האפשרות כי החיה נמצאת כבר במצב של רגישות מרכזית נשללת. האפשרויות הנותרות הן שהחיה היא נורמלית או נאיבית )בסיכוי גבוה( או שהחיה מאולחשת )בסיכוי נמוך(. בשלב השני, נמדדת מידת ההגברה על מנת להבחין בין שתי האפשרויות. מידת ההגברה מוגדרת כיחס שבין ממוצע התגובה הראשונה בשלושת הסדרות )נתון יציב( לבין ממוצע /1 התגובות האחרונות בשתי הסדרות ה.3 rd וה- 2 nd במידה ויחס ההגברה נמוך מ 0 הקבוצה מאולחשת. אולם במידה ומידת ההגברה גדולה מ 1.5 החיה נורמלית. מצאנו גם כי חיות בקבוצה המרוגשת מראות מידת הגברה גדולה מ 4 במבחן זה. כדוגמה לשימוש באלגוריתם זה נבחן את שלוש הקבוצות המוצגות באיור 18. בדיקת קבוצה ראשונה. בשלב I: מצאנו אפקט עיקרי לסדרה ]0001.0>p (2,102)F[, ;47.681= כלומר קיים WoW מובהק. מתוצאה זו ככל הנראה מדובר בקבוצה הנורמלית אולם גם הקבוצה המאולחשת עשויה לענות על מאפיין זה. בשלב :II על מנת להבחין בין הקבוצות נמצא את היחס 77